Sublingual immunterapi som et alternativ til at yde beskyttelse mod akutte luftvejsinfektioner

Summary

The present work illustrates the convenience of using sublingual immunotherapy to boost the innate immune response in the lungs and confer protection against acute pneumococcal pneumonia in mouse.

Abstract

Sublingual route has been widely used to deliver small molecules into the bloodstream and to modulate the immune response at different sites. It has been shown to effectively induce humoral and cellular responses at systemic and mucosal sites, namely the lungs and urogenital tract. Sublingual vaccination can promote protection against infections at the lower and upper respiratory tract; it can also promote tolerance to allergens and ameliorate asthma symptoms. Modulation of lung’s immune response by sublingual immunotherapy (SLIT) is safer than direct administration of formulations by intranasal route because it does not require delivery of potentially harmful molecules directly into the airways. In contrast to intranasal delivery, side effects involving brain toxicity or facial paralysis are not promoted by SLIT. The immune mechanisms underlying SLIT remain elusive and its use for the treatment of acute lung infections has not yet been explored. Thus, development of appropriate animal models of SLIT is needed to further explore its potential advantages.

This work shows how to perform sublingual administration of therapeutic agents in mice to evaluate their ability to protect against acute pneumococcal pneumonia. Technical aspects of mouse handling during sublingual inoculation, precise identification of sublingual mucosa, draining lymph nodes and isolation of tissues, bronchoalveolar lavage and lungs are illustrated. Protocols for single cell suspension preparation for FACS analysis are described in detail. Other downstream applications for the analysis of the immune response are discussed. Technical aspects of the preparation of Streptococcus pneumoniae inoculum and intranasal challenge of mice are also explained.

SLIT is a simple technique that allows screening of candidate molecules to modulate lungs’ immune response. Parameters affecting the success of SLIT are related to molecular size, susceptibility to degradation and stability of highly concentrated formulations.

Introduction

The overall goal of this work is to illustrate the benefits of sublingual immunotherapy for the treatment of acute respiratory infections (ARI) and present the advantages of this delivery route compared to other routes of administration, namely intranasal.

ARI cause millions of deaths every year especially in children under five. Streptococcus pneumoniae remains as one of the major etiological agents of bacterial pneumonia in infants and the elderly^1,2. To present, the main available treatment relies on the use of antibiotics but resistant strains are continuously arising^3,4.

SLIT induces broad responses at systemic and also mucosal level, particularly at the respiratory tract⁵. It has proven effectiveness against influenza infection, promoting long term protection with production of humoral and cellular responses^6,7. Besides, it has been shown that prophylactic treatment with bacterial lysates delivered by sublingual route reduced exacerbations of chronic obstructive bronchitis in the elderly⁸ and prevented recurrent respiratory infections in children⁹. SLIT has been widely used for the treatment of allergies and asthma. Clinical studies had not only demonstrated its efficacy to modulate the immune response in the respiratory tract but also its safety¹⁰. Despite the growing interest of pharmaceutical companies and researchers in SLIT, the mechanisms involved in the induction of mucosal immune responses after sublingual delivery of compounds remain obscure. Recently, attention has been focused on the mechanisms promoting tolerance associated with allergen desensitization. It has been proposed that resident and recruited cells at the sublingual mucosa, like dendritic cells and macrophages, can promote tolerance after SLIT^11-13. Dendritic cells of the oral mucosa can promote IFN-gamma and IL-10 producing T helper cells¹¹ as well as recirculate to the distal genital mucosa and promote CD8⁺ T cells¹⁴. However, little is known about the impact of SLIT on innate cells or its capacity to improve pathogen clearance during acute respiratory infections.

The natural control of pneumococcal infection in the lungs greatly depends on the efficient and swift activation of local innate defences. We previously showed that enhancement of lungs’ innate immunity by a single intranasal dose of flagellin (FliC), a TLR5 and NLRC4 agonist, protects 75-100% of mice challenged with a lethal dose of a clinical isolate of Streptococcus pneumoniae serotype 1. This protection was shown to be dependent on local recruitment of GR1⁺ cells (likely polymorphonuclear neutrophils, PMNs) and not dependent on antibodies, B or T cells¹⁵.

Flagellin is the structural component of the bacterial flagellum. In its monomeric form it is recognized by two Pathogen Recognition Receptors (PRRs), TLR5 that senses extracellular FliC¹⁶ and NLRC4/NAIP5 inflammasome that detects intracellular flagellin^17,18. When FliC is sensed by the PRRs an important inflammatory response is triggered. We and others have demonstrated that instillation of purified FliC from Salmonella enterica serovar Typhimurium into the lungs drives swift production of chemokines and cytokines specially when recognized by the lungs’ epithelium that in turn orchestrate the recruitment of immune cells into the airways, mainly PMNs^15,19-21. Although transient, the substantial neutrophil infiltration that takes place into the airways after nasal delivery of FliC could be a concern if moving towards clinical therapies for human use. Excessive inflammation could be detrimental for the lungs’ function. Moreover, it has been shown that intranasal delivery of immunostimulatory molecules may cause facial paralysis and/or brain toxicity^22-24.

Sublingual immunotherapy offers a safer alternative to modulate the immune response in the respiratory tract compared to the intranasal route. It is non-invasive, painless, simple and has good patient compliance²⁵. Furthermore, as mentioned before, it can induce protective responses in the respiratory mucosa without the risks associated to direct intranasal or intrapulmonary delivery of formulations. Sublingual route could be alternatively used to deliver molecules that have great effects onto the lung’s immune system but that have been proven to be toxic or to elicit great inflammation when administered intranasally. Besides these advantages, formulations for sublingual immunotherapy have lower cost of manufacture since non-sterile products can be delivered by this route and endotoxic shock is not a concern for SLIT. On the other hand, it is worth noticing that higher doses of the immunostimulatory compounds compared to those used by intranasal or parenteral routes are necessary to induce an immune response in the lungs; also highly concentrated solutions are needed when using the mouse model of SLIT since the anatomical site where the formulations are deposited is small.

Based on our previous published data, we developed a model of protection using sublingual immunotherapy with flagellin as model immunostimulant. We demonstrated that a single dose of flagellin induced 60% survival against invasive pneumococcal pneumonia caused by the serotype 1 strain while all mice in the control group died of infection within 5 days. Flow cytometry analysis showed that higher numbers of PMN are recruited into the airways of protected animals after sublingual treatment with flagellin suggesting that these cells might be involved in the mechanism of protection induced by sublingual immunotherapy.

This video shows in detail how to perform sublingual immunotherapy and also how to recover relevant tissue from the sublingual mucosa, draining lymph nodes as well as lungs and airways to perform further analysis. Additionally, it illustrates the general technique of cell preparation for FACS analysis and briefly shows how to prepare Streptococcus pneumoniae suspensions and how to perform intranasal infections in mouse to set up the acute infection model.

Protocol

Procedurer, der involverer dyr blev udført i overensstemmelse med protokoller N ° 071140-000821-12 og 08052010 godkendt af honorære Kommission for Dyreforsøg og direktivet bestyrelse School of Medicine, Universidad de la República – Uruguay. 1. sublingual administration af det terapeutiske middel Forbered opløsningen indeholdende det terapeutiske middel, der skal testes. Juster koncentrationen at administrere et maksimalt volumen på 10 pi per mus. BEMÆRK: renset flagellin fra Salmonella enterica serovar typhimurium den optimale dosis til at yde beskyttelse i mus inficeret med den første dødelig dosis af S. pneumoniae serotype 1 E1586, der forårsager 100% mortalitet er 10 ug / mus. Flagellin opløsning skal opvarmes ved 65 ° C i 5 minutter for at sikre frigivelse af monomerer. For mere information om flagellin oprensning se reference 26. Vary effektiv koncentration af forskellige immunmodulerende midler ifølge dens molekylære størrelse, renhed, modtagelighed for proteolyse og anvendelse af mucoadhæsive midler. Juster optimal koncentration for hver forbindelse, der skal testes for at maksimere dens virkninger. Hvis der er foretaget tidligere undersøgelser intranasal rute for en bestemt forbindelse, bruger en startdosis 5 til 10 gange højere for at teste effektiviteten af ​​sublinguale. Bedøve musene ved at indsprøjte en cocktail indeholdende 110 mg / kg ketamin med 5,5 mg / kg Xylacine og lade dyrene hvile i 7 til 10 minutter. Bekræft ordentlig bedøvelse ved forsigtigt at trykke trædepuden af ​​et af bagbenene; hvis de er korrekt bedøvet at dyret ikke vil bevæge sig som reaktion på stimulus. Spred et tyndt lag af dyrlægen salve i øjnene på hver mus for at forhindre tørhed under anæstesi. BEMÆRK: inhalatorisk bedøvelsesmidler som isofluoran kan også anvendes i stedet Ketamin / Xylacine hvis et system udstyrePED med induktion kammer og næse kegler er til rådighed. Brug induktion kammer for at bedøve dyrene og administrere immunstimulerende af sublinguale rute. Forbinde Umiddelbart dyret til en næsekegle i mindst 15 minutter for at holde det under bedøvelse for at undgå at sluge og tillade absorption af den terapeutiske forbindelse. Pipette opløsningen indeholdende immunstimulerende eller køretøj kontrol løsning; ved hjælp af tommel-og pegefinger på den ikke-dominerende hånd tage musen og holde den i lodret position. Brug af dominerende hånd sted et par lukkede pincet under tungen og holde det på plads ved hjælp af de midterste og ring fingre, åbne pincet lidt for at løfte tunge. Tag pipette og administrere opløsningen på gulvet i munden og dorsale side af tungen. Fjern pincet og lad musen hvile i 3 til 5 minutter, før du sætter det tilbage i buret. For at sikre at normotemperatur opretholdes i bedøvede mikrofone, forbinde bure til et bur varmesystem. Hvis et sådant system ikke er tilgængelig, skal du placere mus tilhører den samme behandling gruppe tilbage til den tilsvarende bur man ved siden af ​​hinanden over strøelse og delvist dække dem med rene tissuepapirark at hjælpe dem med at opretholde kroppens temperatur. Saml vævsprøver på noget tidspunkt efter instillation af immunmodulerende middel til at analysere ændringer i cellepopulationer induceret af behandlingen. BEMÆRK: I denne særlige protokol administration af flagellin blev udført 2 timer før udfordring. Bestem optimale tidspunkt mellem behandling og udfordring for hver enkelt terapeutisk middel og patogenet, der skal testes. 2. Udarbejdelse af bakteriesuspension og Intranasalt Challenge med Streptococcus pneumoniae BEMÆRK: S. pneumoniae er et naturligt humant patogen, der kan forårsage livstruende sygdomme som invasiv lungebetændelse, sepsisog meningitis. Overførsel kan ske, når den indåndes eller i kontakt med slimhinden. Derfor skal alle prøver, der kan have været i kontakt med S. pneumoniae skal håndteres på en hensigtsmæssig Biosikring Niveau II-anlægget ved hjælp af en klasse II-biosikkerhed kabinet. Kontroller Standard Operating Procedures for dit institutionens håndtering af type II patogener beskyttelsesbeklædning, bortskaffelse af affald og yderligere sikkerhedsforanstaltninger, der kan gælde. Smittede dyr bør holdes i individuelt ventilerede bure i isolatorer udstyret med HEPA-filtre. Anti-pneumokok vacciner og antibiotikabehandling er til rådighed. For mere information se referencer 27 og 1. Optø en portion af et arbejdslager suspension af Streptococcus pneumoniae af kendt bakteriel CFU antal fremstillet som beskrevet i 15. Centrifugeres i 5 minutter ved 2.500 xg og RT. Supernatanten fjernes, og vaske bakteriepelleten ved at suspendere det i 1 ml sterile saltvandsopløsning. Brug filter tips, når forbereder bakteriesuspension, fortyndinger eller for dyrs udfordring. Der centrifugeres igen som beskrevet i trin 2.2. Supernatanten fjernes, og pellet resuspenderes i en passende mængde sterilt saltvand for at opnå en suspension af 4×10 5 CFU / 50 pl. Denne dosis svarer til den minimale bakteriedosis S. pneumoniae serotype 1 E1586, der forårsager 100% dødelighed i BALB / c-mus ifølge tidligere undersøgelser 15. BEMÆRK: Ved etablering af en model af lungebetændelse forårsaget af pneumokokker i mus, er det mindste bakteriedosis forårsager 100% dødelighed skal bestemmes for hver enkelt kombination af bakteriel stamme, serotype og mus stamme. Homogeniseres bakteriesuspension ved hvirvelbehandling eller pipettering op og ned 5 gange. Load 50 pi af bakteriesuspensionen anvendelse af en steril filter spids og bibringe det samlede volumen i næseborene af en anæstetiseret mus. Hold museknappen Upright i 2 minutter og lad den hvile i rygleje til 2 flere min. Påfør dyrlæge salve på øjne og returnere dyrene til buret; Sørg for at vedligeholde normotermi mens under anæstesi. BEMÆRK: I denne undersøgelse bakteriel udfordring blev udført i et volumen på 50 pi til at sikre levering af mindst 90% af det samlede CFU i lungerne som bestemt tidligere 15,28. For at minimere angst dyrets mindre volumener (fx 20 ul) kan anvendes. Dog skal effektiv levering af bakterier i lungerne kontrolleres; dette kan gøres ved at høste lungerne 5 minutter efter udfordring og tælle CFU i lungekarmodstanden homogenater ved udpladning seriefortyndinger på plader blod-agar. Bekræft CFU numre i bakteriesuspensionen anvendt til infektion ved udpladning serielle 10-fold fortyndinger onto blodagarplader. Inkuber O / N ved 37 ° C med 5% CO 2 og tælle antallet af mucoide kolonier præsentere en grøn halo karakteristisk for alpha hæmolytiske bakterier. 3. Tissue Indsamling og Prøveforberedelse til flowcytometri (FACS) 3.1) Tissue samling Aflive dyret ved cervikal dislokation eller ved hjælp af en CO 2 kammer; åbne brysthulen hele vejen op til halsen og lave et snit langs de forreste ben for at eksponere den ventrale side af halsen og submandibulære område. Med fin spids buede pincet forsigtigt trække op spytkirtlerne og tilstødende blødt væv for at blotlægge den dorsale side af munden gulvet. Brug buede tynde spids pincet, tage mandibular og tilbehør mandibulære lymfeknuder ved at trække op blidt og placere dem i et rør indeholdende komplet RPMI (cRPMI for 500 ml- 10% føtalt bovint serum, 5 ml af en opløsning indeholdende 10.000 U / ml penicillin og 10 mg / ml streptomycin-opløsning og 5 ml L-glutamin 200 mM) eller nukleinsyre konserveringsmiddel opløsning ifølge den nedstrøms procedure, der vilskal udføres senere. For at åbne brysthulen lave et snit i mellemgulvet; ved hjælp af et par af rotte-tandede pincet klemme den Xyphoid brusk af brystbenet og forsigtigt skære ribbenene i begge dorsale sider startende fra falske ribben hele vejen op, indtil den når det punkt, hvor de sande ribben mødes manubrium af brystbenet. Ved at holde Xyphoid brusk af brystbenet med pincet, træk forsigtigt op for at blotlægge organer i brysthulen. Tag ribbenene fuldstændigt ved at skære de første ribben og kravebenet. Thymus vises som et hvidt struktur med to kamre beliggende i anteroventral del af thorax tæt på bunden af ​​hjertet. Tag en af ​​de lapper ved at klemme den med en pincet og bruge en saks til at fjerne de ledbånd mellem dens ringere ansigt og hjertesækken. Fortsæt at fjerne den anden lap. Identificer bughulen og åbn den ved at skære langs midteraksen af ​​de muscular væg at eksponere organer. Med en tang skære den bageste vena cava og thorakalaorta; fjerne overskydende blod med et absorberende væv. At analysere de bosiddende og lepopulationer af alveolerne udføre bronchoalveolær lavage (BAL). Skær musklerne i den ventrale del af halsen at eksponere luftrøret og spiserøret; at adskille dem gøre indsnit i laterale og dorsale side af strukturerne. Løft luftrøret med pincet og lave et lille snit med en skalpel for at indføre en tynd spids overførselspipetten fyldt med 1 ml PBS uden Ca2 + / Mg2 + plus 1 mM EDTA. Indgyde og aspirere den samlede mængde mindst tre gange; aspireres og overføre cellesuspensionen til et sterilt 1,5 ml rør og placere den på is. At analysere cellepopulationer stede i lungeparenkym først perfuse lungerne ved at injicere 5 ml PBS uden Ca2 + / Mg2 + plus 1 mM EDTA i højre hjertekammeraf hjertet. BEMÆRK: Dette vil fjerne de fleste af de røde blodlegemer og immunceller til stede i lungerne 'blodkar. Hvis perfusion blev udført korrekt, vil lunger farveskift fra lyserød til hvid. Isoler hjertet fra lungerne ved at klemme den fra bunden af ​​den venstre ventrikel og fint skåret blodkarrene med en saks for at fjerne det helt. Tag perfusionerede lunger og placere dem i cRPMI eller nukleinsyre konserveringsmiddel løsning afhængigt af den nedstrøms til analyse. Til analyse af cellepopulationerne i den sublinguale slimhinde, isolere lederen af ​​dyret og fjerne spytkirtlerne og tilstødende blødt væv, hvis det ikke er blevet gjort i trin 3.2.1. Lav et snit på hver side af munden, indtil den når underkæbe fælles og adskille ringere kæbe sammen med tungen og gulv i munden, ved hjælp af stifter ordne det på dissektion bord. Træk op tungen; hjælp af en skalpel lave et snit, hvor base af tungen opfylder gulvet i munden, indtil den når den tredje molarer for at blotlægge den sublinguale slimhinde. Tag tungen helt; tage en 0,5 mm biopsitang og placere den ved siden af ​​de nedre fortænder. Skær fra gingival indsættelse af den sublinguale væv og tryk forsigtigt, indtil gulvet i munden er skåret helt ud. Gentag en gang nu placere biopsitang tæt på tredje molarer for at fuldføre fjernelsen af ​​den sublinguale væv. Placer på en ren rør indeholdende cRPMI eller nukleinsyre konserveringsmiddel. 3.2) forberedelse Prøve til FACS-analyse. Overfør lungerne væv isoleret fra hver mus i en 24-brønds plade og mos dem med en ren saks indtil opnåelse af små stykker af væv på cirka 2 mm. 1 ml per brønd af fordøjelse medium indeholdende 30 mg af type II-collagenase, 50 ug DNAse-I i 1 ml RPMI uden FBS. Pipette op og ned fem gange og inkuberes ved37 ° C og 5% CO2 i 40 minutter. Til analyse af cellepopulationer i den sublinguale væv erstatte fordøjelsen medium i 3.2.1 med et indhold af 2 enheder Dispase, 30 mg type II collagenase 50 ug DNAse-I i 1 ml RPMI. Inkubér væv opsamlet fra en mus i 500 ul fordøjelse medium i 20 min ved 37 ° C i en orbitalryster ved 50 rpm. Efter inkubation pipette op og ned op til 10 gange eller 30 sek indtil det meste af væv er blevet ødelagt. Filtreres cellesuspensionen selvom en 40 um steril cellefilter og vaskes med 5 ml PBS suppleret med 5 mM EDTA. BEMÆRK: Fuldstændig fordøjelse af den ekstracellulære matrix og fibrøst væv ikke vil blive nået. Imidlertid er længere inkubationstider i nærværelse af collagenase og / eller dispase eller aggressiv triturering ikke anbefales, da det vil resultere i forøget celledød og destruktion af ekstracellulære proteiner, der påvirker det samlede resultat af FACS analyse. Der centrifugeres ved 400 xg 5 min, 4 ° C. Til analyse af cellepopulationerne i BAL, centrifugeres cellerne ved 400 xg 5 min ved 4 ° C og fortsætte til trin 3.2.4. Til analyse af cellepopulationer i lymfeknuderne, placere en 70 um cellefilter på en steril petriskål og sætte lymfeknuder sammen med 1 ml cRPMI i sien. Tag springet til et 2 ml steril sprøjte og bruge det som en støder til at knuse lymfeknuderne mod si s mesh. Skyl cellefilter med 1 ml frisk cRPMI og overføre cellerne fra petriskålen til et sterilt rør. Tag en repræsentativ delmængde af hver prøve og plette den med trypanblåt for at bestemme antallet af levedygtige celler. Cellerne i FACS-EDTA: PBS-5 mM EDTA-1% bovint Albumin- at gøre op en suspension af 2×10 7 celler / ml, og der tilsættes 50 ul i et cytometer rør. Forbered en 2X antistof blanding indeholdende caopriate kombinationer af antistoffer mod overflademarkører og fluorochromer Ifølge de foreliggende FACS instrument. Der tilsættes 50 ul af 2X antistof blandingen i hvert rør, der indeholder cellesuspensionen. BEMÆRK: hvert fluorochrom-mærket antistof for at bestemme den optimale mængde titreres der skal anvendes, for en detaljeret protokol, se reference 29. Inkuber 30 minutter på is i mørke. Vask en gang med 3 ml FACS-EDTA og spin ned cellerne ved centrifugering ved 400 xg i 5 minutter ved 4 ° C, cellerne resuspenderes i 200 pi af den samme buffer og analysere et flowcytometer. BEMÆRK: Hvis håndtering af et stort antal prøver kan farvningsprotokol til FACS-analyse beskrevet ovenfor udføres i U-bottom 96-brønds plader i stedet for cytometer rør. Imidlertid skal, hvis der anvendes 96-brønds plader vasketrin udføres ved at tilsætte op til 200 pi FACS-EDTA og gentage den 4 gange spinning ned cellerne ved 400 x g i 5 minutter ved 4 ° C mellem hver Washing trin. På dette tidspunkt, fastsætte prøver til analyse i flowcytometeret senere (op til 72 timer efter fiksering). Du kan løse cellerne, efter mærkning med FACS-antistoffer vaskes cellerne i PBS ingen Ca 2 + / Mg2 +, 1 mM EDTA uden FBS. Suspender cellerne i 50 pi af den samme buffer, og der tilsættes 50 pi af en frisk fremstillet 4% paraformaldehydopløsning i hypertonisk (2X) PBS-nr Ca 2 + / Mg2 +. Inkuber i 20 minutter ved stuetemperatur og vaskes 3 gange i FACS-EDTA. Resuspender cellerne i 200 pi FACS-EDTA og opbevares ved 4 ° C og beskyttet mod lys, i op til 72 timer. BEMÆRK: FSC-SSC kan påvirkes af fiksering. Hvis fastsættelse af prøverne kontrollerer kompatibilitet fluorescens-mærkede antistoffer med producenten, da tandem farvestoffer kan nedbrydes i nærværelse af fikseringsmiddelpartiklerne agenter. Hvis prøverne stammede fra inficerede dyr fiksering anbefales stærkt at sikre, at ingen levedygtige patogener vil være til stede, når analysynge prøverne i FACS maskine da microaerosols kan genereres i forbindelse med købet af prøven. 4. Total RNA ekstraktion, cDNA syntese og Real Time PCR. 4.1) RNA-ekstraktion og cDNA-syntese. Homogeniseres vævet i nukleinsyre konserveringsmiddel opløsning af valg ved mekanisk forstyrrelse (f.eks ved hjælp af en rotor-stator-homogenisator med høj hastighed ryster væv ruptor og perler, etc.). Der centrifugeres ved 12.600 xg i 15 minutter og 4 ° C for at fjerne vævsrester. Supernatanten overføres til et rent rør. Ekstraheres RNA med den foretrukne fremgangsmåde i overensstemmelse med producentens instruktioner. BEMÆRK: RNA er meget modtagelige for nedbrydning, hvis det ikke skal bruges straks efter isolering, gør portioner og gemme dem i RNAse gratis rør ved -80 ° C. Undgå gentagen nedfrysning og optøning. Rørene skal håndteres med handsker på alle tidspunkter. Efter optøning af prøverne enlways holde dem på is. Absorbansen af ​​nukleinsyrer ved 260 nm og beregne koncentrationen i pg / pl. Forbered DNAse-I blandes ved tilsætning af (i 1 prøve): 7.6 pi ultrarent vand, 1 pi 10X DNAse I-puffer, 0,4 ul DNAse-I (opformering kvalitet) lager 1 U / ul, og add 8.4 pi DNase-I blandes til hver prøve indeholdende 1 ug totalt RNA. Brug RNA ved en koncentration på 1 pg / pl og udfører retrotransskription reaktion (RT-PCR) ved tilsætning af 1 ml af det totale RNA som skabelon. Hvis prøverne er for fortyndet, og koncentrationen er lavere end forventet, tilsættes større mængder af totalt RNA i stedet for vand. Må ikke overstige 20% af den endelige reaktion volumen, når du tilføjer RNA specielt hvis RNA-ekstraktion protokol valg involveret phenol-chloroform-blanding, da phenol spor kan påvirke udbyttet af RT-PCR. Inkuber 15 minutter ved stuetemperatur efterfulgt af 10 minutter ved 4 ° C eller ice. (Må ikke overstige inkubationstiden !!) Tilsæt 1 pi EDTA 25 mM (molekylærbiologisk kvalitet) til hvert rør og inkuberes ved 65 ° C i 10 minutter for at inaktivere DNAse-I. Forbered retrotransskription (RT) blanding som følger (for 1 reaktion): 1 pi tilfældige hexamerprimere stock 0,2 mg / ml, 1 pi dNTP lager 10 mM, 4 pi 5X M-MLV-RT buffer, 2 pi DTT 0,1 M, 1 pi RNAse OUT lager 40 U / ul, og 1 pi M-MLV retrotranscriptase lager 200 U / ul. Der tilsættes 10 ul af RT-PCR-blandingen til 10 ul DNAse I-reaktionsrør. Udføre PCR-reaktionen i en thermocycler ifølge følgende program: 1X cyklus: 10 min, 25 ° C; 50 min, 37 ° C; 15 minutter, 70 ° C Fortynd cDNA 1: 5 ved tilsætning af 80 pi ultrarent vand. Opbevar ved -20 ° C. 4.2) Real time PCR (qPCR). Forbered qPCR reaktion mix som følger (for 1 reaktion): 5 ul mester blanding indeholdende Taq-DNA-Polymerase, SYBR grønt farvestof, PCR-buffer, dNTP mix og MgCl2 (se 4.2.2 nedenfor); 0,9 pi af en 10 pM stamopløsning af den fremadrettede primer, 0,9 pi af en 10 pM stamopløsning af den reverse primer, 1.2 pi ultrarent vand, og 2 pi af cDNA skabelon tidligere fortyndet som anført i trin 4.1.10. BEMÆRK: reagenskoncentration og cykling protokoller, der anvendes i dette afsnit, er optimeret til at blive udført specifikt med reagenser og instrumenter, der er beskrevet i "Tabel for Materialer og reagenser", andre mærker kan bruges, men reaktionsvolumener kan reagenskoncentration og cykling protokol variere. Tjek dine producentens anvisninger, før RT-qPCR. Opsæt qPCR instrumentet på følgende måde: 1X cyklus: 15 min, 95 ° C 40X cykler: 15 sek, 95 ° C efterfulgt af 1 min, 60 ° C (på dette tidspunkt erhverve fluorescens). BEMÆRK: For at relativ kvantificering af mRNA ifølge Ct metode 30 a reference gen skal vælges for normalisering af Ct-værdier. Henvisning gen af valg bør afprøves under specifikke assaybetingelser som sit udtryk kan variere, ACTB, GAPDH eller 18S er nogle af de gener, der sædvanligvis valgt som referencer. Opsætning af tærskelværdien og analysere data.

Representative Results

Sublingual immunterapi med held kan anvendes til at modulere respons lungerne immunsystem. Vi viste, at en enkelt dosis af flagellin den TLR5 og NLRC4 agonist, kan inducere signifikant opregulering af mRNA, der koder kemokiner CXCL1, CCL20 og cytokin IL-6 sammenlignet med saltvandsbehandlede kontroller. Fold induktion af mRNA-niveauer toppede på 8 timer efter SLIT og vende tilbage til basisniveauer efter 20 timer (figur 1). Men når SLIT blev udført 2 timer før intranasal infektion med S. Pneumoniae niveauer CXCL1 og IL6-mRNA forblev signifikant opreguleret selv 24 timer efter SLIT i forhold til ikke-behandlede dyr (figur 2). Analyse af cellepopulationer i BAL og lungevævet ved FACS afslørede, at dyr behandlet med FLIC af sublinguale havde øget antal neutrofiler i luftvejene, men ikke i lungerne væv (figur 3). <p class = "jove_content"> Endelig blev overlevelse efter pneumokok udfordring i forhold til dyr som tidligere er behandlet med Flic af sublinguale rute eller med saltvand som kontrol. Som vist i figur 4, SLIT med flagellin fremmes beskyttelse og forøget overlevelse mod akut pneumokokpneumoni. Figur 1. Kinetik lungens transkriptionelle profil efter sublingual immunterapi med flagellin. Otte til 10 uger gamle BALB / c-mus (n = 4) blev behandlet med 10 ug flagellin eller saltvand ved sublinguale under anæstesi. Lunger blev opsamlet på forskellige tidspunkter og placeret i nukleinsyre konserveringsmiddel. Total RNA-ekstraktion blev udført, og cDNA blev syntetiseret. mRNA-niveauer blev evalueret ved real time PCR under anvendelse af specifikke primere, der er opført i Table 1. Relativ kvantificering blev udført i overensstemmelse ACt metode under anvendelse ACTB mRNA niveauer for normalisering. Resultater er vist som fold stigning sammenlignet med saltvand behandlede gruppe som median ± SEM. Stjerner angiver statistisk signifikante forskelle (p <0,05) beregnet ifølge Mann-Whitney-testen. Resultaterne er repræsentative for 2 uafhængige forsøg. Figur 2. Lunger 'transskriptionsprofilen under pneumokokpneumoni efter sublingual immunterapi med flagellin. Otte til 10 uger gamle BALB / c-mus (n = 4 for kontrolgruppen og n = 7 for behandlet gruppe) blev behandlet med 10 ug flagellin eller saltvand ved sublinguale under anæstesi. 2 timer senere blev musene udfordret ved intranasal rute med den minimale dødelige dosis (MLD) forårsager 100% mortalitet af et klinisk isolat af S. pneumoniae-serotype 1-E1585, svarende til 4×10 5 CFU / 50 pi. Lunger blev opsamlet 24 timer efter udfordring og opbevares i nukleinsyre konserveringsmiddel indtil RNA-ekstraktion og cDNA-syntese blev udført. Real time PCR blev udført (Se primer liste i tabel 1) og relativ kvantificering blev udført ifølge ACt metode under anvendelse ACTB mRNA niveauer for normalisering. Resultater er vist som fold stigning sammenlignet med saltvand behandlede gruppe som median ± SEM. Stjerner angiver statistisk signifikante forskelle (p <0,05) beregnet ifølge Mann-Whitney-testen. Figur 3. Analyse af polymorfkernede neutrofile (PMN) rekruttering i lungerne væv og luftveje efter slids. Otte til10 uger gamle BALB / c-mus (n = 4) blev behandlet med 10 ug flagellin eller saltvand ved sublinguale under anæstesi. 2 timer senere blev musene udfordret intranasalt med MLD S. pneumoniae-serotype 1-E1585. 24 timer efter udfordring blev BAL udført, og lungerne blev forarbejdet til FACS-analyse. PMN blev identificeret som Ly6G høj / CD11 høj / CD11c-negative celler og baseret på FCS-SSC profil. Resultaterne er udtrykt som procent af PMN med for de samlede celleantal i BAL eller lungerne. Søjler repræsenterer medianen ± SEM. Stjerner angiver statistisk signifikante forskelle (p <0,05) beregnet i henhold til envejs-Mann-Whitney-testen. Figur 4. SLIT med flagellin beskytter mus mod akut lungebetændelse forårsaget af pneumokokker. </strong> Otte til 10 uger gamle BALB / c-mus (n = 8) blev behandlet med 10 ug flagellin eller saltvand ved sublinguale under anæstesi. 2 timer senere blev musene udfordret intranasalt med MLD S. pneumoniae-serotype 1-E1585. Overlevelse blev vurderet på en daglig basis. Kaplan-Meier kurver blev sammenlignet efter log-rank (Mantel-Cox) test. Stjerner angiver statistisk signifikante forskelle (p <0,05) .Results er repræsentative for to uafhængige forsøg. Navn 5'-3 ' PCR-produkt længde (bp) mB-actin_F GCTTCTTTGCAGCTCCTTCGT 68 mB-actin_R CGTCATCCATGGCGAACTG mCCL20_F TTTTGGGATGGAATTGGACAC 69 mCCL20_R TGCAGGTGAAGCCTTCAACC mCXCL1_F CTTGGTTCAGAAAATTGTCCAAAA 84 mCXCL1_R ACGGTGCCATCAGAGCAGTCT MIL-6_f GTTCTCTGGGAAATCGTGGAAA 78 MIL-6_R AAGTGCATCATCGTTGTTCATACA mTNFalpha_F CATCTTCTCAAAATTCGAGTGACAA 63 mTNFalpha_R CCTCCACTTGGTGGTTTGCT mCxcl2_F CCCTCAACGGAAGAACCAAA 72 mCxcl2_R CACATCAGGTACGATCCAGGC Tabel 1. Primer liste anvendes til tidstro PCR-analyse. Specifikke primersekvenser, der anvendes til qPCR analyse. Frem og bak primere til mus ACTB er Cccl20, CXCL1, IL6, TNFa og CXCL1 præsenteret som 5'-3 'sekvenser og produktudvikling længde forventet er angivet i basepar (bp).

Discussion

Sublingual administration af terapeutiske midler har vist sig som et nyttigt middel til at modulere immunresponset i luftvejene. Den største fordel af SLIT til behandling af luftvejssygdomme er, at det ikke indebærer direkte levering af forbindelser til lungerne eller næsebor, er sikrere end behandlinger baseret på intranasal administration ^31.

Sublingual immunterapi kan anvendes til at modulere immunreaktionen på forskellige måder, enten til induktion af regulatoriske responser, der kan mildne symptomerne på allergisk inflammation og astma ³² eller at inducere forbigående aktivering af medfødte immunmekanismer til behandling af akutte lungeinfektioner, som vist her.

Den musemodel præsenteres i denne video er en bekvem metode til screening af forskellige forbindelser som terapeutiske midler til SLIT.

Dette dyr model tilbyder et nyttigt middel til at fastslå virkningenaf SLIT reaktion lungerne immunsystem såvel som i andre organer (f.eks., drænende lymfeknuder eller distale slimhinder), der ikke kan efterlignes ved anvendelse af in vitro-modeller. Selv om der er flere papirer, der beskriver resultater opnået ved hjælp af sublingual immunterapi, ikke er blevet fremsat detaljerede metoder til procedurerne i sublingual indgivelse til rådighed endnu. Derudover kan modellen anvendes til evaluering af sublinguale vacciner til formål at give systemisk samt lokal beskyttelse i luftvejene.

Som vist i den ledsagende video, sublingual indgivelse af forbindelser er en simpel procedure, der let kan udføres uden behov for omfattende træning. Typisk vil en person dygtige i håndtering af dyr kræver 1 time at udføre SLIT i en gruppe af 10 mus bruger injicerbar bedøvelsesmidler som beskrevet i denne protokol. Hvis der udføres pneumokok udfordring så godt, vil 90 ekstra minutter skal udarbejdebakteriesuspensionen og udfør intranasal udfordring af dyrene.

FACS protokoller præsenteres her tillader bekvem karakterisering af virkningen af ​​SLIT på det lokale stedet for administration drænende lymfeknuder samt deres effekter på lungerne 'celle dynamik.

Separat analyse af bronkoalveolær indhold og lungeparenkym er vigtigt at skelne luftvejene immunsystem hjemmehørende og infiltrerende celletyper fra dem, der forbliver i vævet. Analyse af BAL indhold muliggør studiet af alveolær makrofag såvel omsætning som dynamikken i cellerne rekruttering til de alveolære rum induceret af forskellige behandlinger, f.eks., PMN'er, eosinofile, monocytter. BAL kan også anvendes til at vurdere tilstedeværelsen af ​​udskilte cytokiner og chemokiner ved enzym-bundet immunosorbent assay (ELISA) eller detektion af secernerede IgA-antistoffer fremkaldt efter sublingual vaccination. Undersøgelse af lungerne 'vævvil tillade karakterisering af andre celletyper, klassisk dendritiske celler, T-celler og B-celler.

Fremstilling af BAL-prøver og lymfeknuder til FACS-analyse er enkel. Efter prøvetagning, normalt 60 minutter kræves for at fuldføre farvningsprotokol i 10-20 prøver. I modsætning hertil vil isolering af celler fra lungerne eller sublinguale væv kræver mere tid, eftersom nedbrydning af den ekstracellulære matrix er påkrævet. Absorption af det terapeutiske middel leveret af sublinguale rute kan løses ved sporing af fluorescens eller radioaktivt mærkede molekyler under anvendelse af in vivo billeddannelse.

Sublingual immunterapi er en attraktiv metode til effektivt at inducere immunresponser i luftvejene samt systemisk, som kan anvendes til at behandle eller forebygge respiratoriske tilstande. Belysning af de mekanismer, der bestemmer aktivering vs tolerance over for immunreaktion i luftvejene efter SLIT Is afgørende at tillade rationelt design af nye terapeutiske strategier, der kan anvendes alene eller i kombination med tilgængelige behandlinger mod forskellige luftvejssygdomme.

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Ketamine solution (50 mg/ml)	Pharma Service, Uruguay	N/A
Xilacine solution (2 %)	Portinco S.A., Uruguay	N/A
Sterile 1ml syringe	Modern, Uruguay	N/A
Sterile 27G needle	Modern, Uruguay	N/A
RPMI 1640	General Electric Health Care	E15885
Fetal Bovine Serum	ATCC	302020
Penicillin/Streptimycin Solution	SIGMA	P4333
Sterile PBS without Ca2+/Mg2+	PAA	H21002
Type-I Collagenase	Life Technologies/Gibco	17100017
Deoxyribonuclease I (DNAse-I)	SIGMA	D4513
Dispase	Life Technologies/Gibco	17105041
PerCP-Cy5.5 conjugated rat anti mouse IgG2b anti CD11b	BD	550993	Clone M1/70
APC conjugated hamster anti mouse IgG1 anti CD11c	BD	550261	Clone HL3
APC-Cy7 conjugated rat anti mouse IgG2a anti Ly6G	BD	560600	Clone 1A8
Sterile Saline Solution	Laboratorio Farmaco Uruguayo, Uruguay	N/A
Tryptic Soy Agar	BD Difco, France	236950
Defibrinated Sheep Blood	Biokey, Uruguay	N/A
Sterile Petri Dishes	Greiner	633180
p10 Pipette	Gilson	F144802
P20 Pipette	Eppendorf	3120000097
p200 Pipette	Gilson	F123601
p200 Pipette	Capp	C200
p200 Pipette	Eppendorf	3120000054
p1000 Pipette	Eppendorf	3120000062
Sterile Filter Tips P10	Greiner	771288
Sterile Filter Tips P200	Greiner	739288
Sterile Filter Tips P1000	Greiner	750288
Vortex	BIOSAN	V1-plus
Stainless steel fine tip forceps	SIGMA	Z168785/Z168777	curved and straight
Dressing tissue forceps	SIGMA	F4392	length 8 inches
Micro-dissecting forceps	SIGMA	F4017	straight
Micro-dissecting forceps	SIGMA	F4142	Curved
Mayo Scissors	SIGMA	Z265993
Scalpel	SAKIRA MEDICAL	N/A
Sterile Biopsy Punch Ø 3mm	Stiefel Laboratories Ltd.	2079D	5mm diameter can also be used
Sterile 1.5ml Tubes	Deltalab	200400P
Sterile 15ml Tubes	Greiner	188271
Sterile 50ml Tubes	Greiner	227261
Sterile serological pipettes 5 ml	Greiner	606160
Sterile serological pipettes 10 ml	Greiner	607160
Sterile serological pipettes 25 ml	Greiner	760180
Biological safety cabinet, class II	Thermo Scientific	1300 series, type A2
Micro-Isolator Rack	RAIR IsoSystem	76144W	Super Mouse 1800 AllerZone
Refrigerated Microcentfifuge	Eppendorf	Legend Micro 21R
Microcentfifuge	Heraeus	Biofuge-pico
Centrifuge	Thermo Scientific	Sorval ST40R
CO2 Incubator	Thermo Scientific	Model  3111
Sterile Thin-tip pasteur pipettes	Deltalab	D210022
Sterile pasteur pipettes	Deltalab	200007
Sterile 24-well plate	Greiner	662160
Trypan Blue Solution	Life Technologies	T10282
Automatic Cell Counter – Cuntess	Life Technologies	C10227
Countess Cell Counting Chamber Slides	Life Technologies	C10312
Flow Cytometry Tubes	BD	343675
Flow Cytometer – FACS Canto-II	BD	N/A
Real Time PCR Instrument – Rotor Gene Q or ABI 7900	Qiagen / Applied Biosystems	N/A
Trizol Reagent	Life Technologies	15596-026	Molecular Biology Grade
DNAse-I	Life Technologies	18068-015	Molecular Biology Grade
DNAse-I Buffer 10X	Life Technologies	18068015	Molecular Biology Grade
EDTA 25 mM	Life Technologies	18068015	Molecular Biology Grade
Ultra-Pure Water	Life Technologies	10977	Molecular Biology Grade
RNAse Out	Life Technologies	100000840	Molecular Biology Grade
Rndom Hexamer Primers	Life Technologies	N8080127	Molecular Biology Grade
M-MLV-RT buffer	Life Technologies	18057-018	Molecular Biology Grade
M-MLV-RT enzime	Life Technologies	28025-021	Molecular Biology Grade
QuantiTect Syber Green PCR Kit	Qiagen	204143	Molecular Biology Grade
Specific primers	Life Technologies	N/A	Molecular Biology Grade