Summary
Modelos animais de doença pediátrica pode experimentar início precoce e progressão da doença agressiva. Clinicamente entrega terapia relevantes para jovens modelos de mouse pode ser tecnicamente difícil. Este protocolo descreve um método de injecção intravenosa não-invasiva para a ratinhos recém-nascidos nos dois primeiros dias pós-natais de vida.
Abstract
A injeção intravenosa é uma forma clinicamente aplicável para entregar terapêutica. Para roedores adultos e animais maiores, injeções intravenosas são tecnicamente viáveis e de rotina. No entanto, alguns modelos de mouse pode ter início precoce da doença com uma progressão rápida que torna a administração de terapias potenciais difícil. A veia temporal (ou facial) é apenas anterior ao botão da orelha em ratinhos e é claramente visível para os dois primeiros dias após o nascimento em cada lado da cabeça, usando um microscópio de dissecação. Durante esta janela, a veia temporal, podem ser injectados com volumes de até 50 ul. A injecção é seguro e bem tolerado por ambas as crias e as barragens. Um procedimento típico de injecção está concluída dentro de 1-2 min, após o que o filhote é devolvida à gaiola de origem. No terceiro dia pós-natal a veia é difícil de visualizar e do procedimento de injeção se torna tecnicamente confiável. Esta técnica tem sido utilizada para a entrega de vírus adeno-associado (AAV) vectors, que por sua vez pode fornecer quase todo o corpo, a expressão do transgene estável durante a vida do animal, dependendo do serotipo viral escolhido.
Introduction
A entrega de agentes terapêuticos ao sistema nervoso central (SNC) em modelos murinos de doença pediátrica continua a ser um desafio. Ratos que modelo estados de doença recém-nascidos são subdimensionados e developmentally imaturo, e, portanto, pode ser difícil de injectar directamente nas estruturas apropriadas dentro do SNC. Injeção intravascular de agentes terapêuticos é um método não-invasivo, bem tolerado para entregar células, drogas ou vetores virais para todo o corpo, incluindo o SNC 1-5 e 3,5-9 retina. Publicações anteriores descrevem injeção veia rosto temporal, utilizando um transiluminador 10,11, sem um microscópio de dissecação 11,12, ou exigindo duas pessoas para injetar 10. A técnica de injeção descritos neste protocolo é vantajoso porque um único indivíduo pode injetar filhotes, ea fonte de luz para ver a veia temporal, não está tocando o filhote, eliminando a necessidade de fita cirúrgica ou a fixação de um filhote de cachorro para uma superfície fixatal como um transiluminador 11. Entrega de adeno-associado vector viral serótipo 9 (AAV9) em ratinhos produz expressão robusta em neurónios e astrócitos em todo o cérebro e na medula espinal (Figura 1). A entrega intravascular de vectores virais na veia facial temporal superficial foi usado de forma fiável em vários estudos em ratinhos neonatais para tratar a doença neuromuscular pediátrica atrofia muscular espinal (SMA) e, finalmente, 2,4,13,14 aumentou o tempo de vida dos ratinhos tratados.
Injecção intravascular de ratinhos neonatais também tem como alvo de forma eficaz o sistema nervoso periférico e órgãos periféricos (Figura 2). Após a injecção de AAV, a transdução de gânglios da raiz dorsal, fígado, coração, músculo esquelético, o pulmão, e do plexo mientérico do intestino foi observada 1,3,6,7,15. Transdução generalizada do sistema nervoso central e periferia torna este método de injeção ideal para doenças que requerem expressão global deum transgene, tais como a doença de 16 e outro de depósito lisossômico doenças de Gaucher, doença de 17,18 Batten e lipofuscinoses Ceróides neuronais relacionados, 19 e síndrome de Bardet-Biedl, uma doença genética do sistema múltiplo com início dos sintomas que ocorrem na infância 20. Injecção intravascular em ratinhos neonatais, também deve ser considerado como um novo método de doenças pediátricas em todo o sistema de modelagem. Esta técnica tem sido traduzido para animais de grande porte 5,21 e injeção intravascular já existe como um método clinicamente aceitável de entregar terapêutica.
O protocolo atual descreve um método simples e eficiente de agentes para ratos neonatais entregar através da veia superficial rosto temporal, o mais tardar até dia pós-natal 2. Injeção pode ser completado por um único, praticada individual e é bem tolerado por ambos os filhotes e as barragens. Filhotes experimentar angústia mínima e recuperar rapidamente. Importantly, injecção bem sucedido resultará na entrega global do agente administrado. Este protocolo é apropriado para a entrega de vectores virais, agentes farmacêuticos ou de células para ratinhos recém-nascidos.
Protocol
Representative Results
Discussion
A entrega intravascular de agentes para o SNC ou por todo o corpo é difícil em modelos murinos de doença neonatal. O protocolo descrito é uma maneira rápida, relativamente não-invasivo para administrar por via intravenosa soluções em camundongos neonatal com requisitos mínimos de equipamento. Embora a cara veia temporal, podem ser vistos a olho nu, as injecções podem ter maior precisão com o uso do microscópio e fonte luminosa de fibra óptica, especialmente para um injector sem prática. Injeções intrave…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores gostariam de reconhecer o NINDS, FightSMA e Famílias de SMA para apoio financeiro. SEGL é suportado por formação NINDS concessão # 5T32NS077984-02.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Thinpro Insulin Syringe | Terumo | SS30M3009 | 3/10cc, 3/8" needle, 30G, 1 per mouse |
| Evans Blue Dye | Sigma-Aldrich | E2129 | Dilute to 1% with 1X Phosphate Buffered Saline |
| Cotton Tipped Applicators | Fisher Scientific | 23-400-101 | |
| Fiber Optic Light Source | Fisher Scientific | 12-562-36 | |
| Dissecting Microscope |
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