Выражение флуоресцентных белков<em> Branchiostoma lanceolatum</em> По мРНК инъекций в неоплодотворенных ооцитов
Summary
Мы сообщаем здесь надежную и эффективную экспрессию флуоресцентных белков после инъекции мРНК в неоплодотворенные ооциты в Branchiostoma lanceolatum. Развитие техники микроинъекции в этом базальной хордовых проложит путь для далеко идущих технические новшества в этой новой модельной системе, в том числе в естественных изображений и геноспецифических манипуляций.
Abstract
We report here a robust and efficient protocol for the expression of fluorescent proteins after mRNA injection into unfertilized oocytes of the cephalochordate amphioxus, Branchiostoma lanceolatum. We use constructs for membrane and nuclear targeted mCherry and eGFP that have been modified to accommodate amphioxus codon usage and Kozak consensus sequences. We describe the type of injection needles to be used, the immobilization protocol for the unfertilized oocytes, and the overall injection set-up. This technique generates fluorescently labeled embryos, in which the dynamics of cell behaviors during early development can be analyzed using the latest in vivo imaging strategies. The development of a microinjection technique in this amphioxus species will allow live imaging analyses of cell behaviors in the embryo as well as gene-specific manipulations, including gene overexpression and knockdown. Altogether, this protocol will further consolidate the basal chordate amphioxus as an animal model for addressing questions related to the mechanisms of embryonic development and, more importantly, to their evolution.
Introduction
Во время разработки, одна клетка порождает весь организм в очень сложного процесса, который включает в себя как деления клеток и движений. Чтобы лучше понять биологические принципы, лежащие в основе динамики поведения клеток, онтогенетики начали использовать флуоресценцию на основе методам естественных изображений. Конкретные отделения клеток, такие как клеточные мембраны, либо могут быть помечены с помощью лечения, с флуоресцентными красителями, подход препятствует отсутствие специфичности и проникновения в ткани 1, или конкретной введения в зародыше экзогенных мРНК, кодирующих флуоресцирующие белки 2. Различные методы могут быть использованы для эффективной доставки экзогенных соединений, таких как мРНК. Они включают, но не ограничиваются ими, микроинъекции, электропорации, бомбардировки микрочастицами, липофекция и трансдукции 3,4. Хотя все эти подходы могут быть использованы для введения экзогенных соединений вразвивающегося эмбриона, только микроинъекции позволяет использовать предопределенные и точных количествах в каждой ячейке 3. Методы Микроинъекция были описаны для всех основных моделей развития систем 4 (например, плодовые мушки, нематоды, данио, лягушек, мышей), а также для некоторых альтернативных моделей 4, в том числе те, которые используются для сравнительных исследований, направленных на понимание эволюции механизмов развития (например, морские анемоны, кольчатые черви, морские ежи, асцидии оболочники, Бесчерепные ланцетника).
Cephalochordates, которые вместе с оболочников и позвоночных животных устанавливают хордовых Тип, особенно хорошо подходят модели для изучения эволюции хордовых и диверсификации позвоночных от беспозвоночных предка 5-8. Бесчерепные линия разошлись очень рано в процессе эволюции хордовых; и дошедшие до нас cephalochordates, которые подразделяются на три рода (отрубиchiostoma, Asymmetron и Epigonichthys), напоминают позвоночных как в плане общей анатомии и генома архитектуры 5-8. Из около 30 видов cephalochordates, которые были описаны до сих пор, пять доступны для эмбриологических и развития исследований 6,9: Asymmetron lucayanum (Багамы ланцетника), Branchiostoma floridae (ланцетника Флорида), Branchiostoma lanceolatum (Европейский ланцетника), Branchiostoma belcheri (китайский ланцетника) и Branchiostoma japonicum (Японский ланцетника). Спелые взрослые трех этих видов (B. lanceolatum, Б. belcheri и B. japonicum) может быть вызван на нерест по требованию в течение сезона размножения 10,11. Кроме того, по крайней мере для В. lanceolatum, эффективный нерест может также быть вызван в искусственной морской воде 12, тем самым делая это конкретные виды Бесчерепные доступны для лаборатох годов, которые не имеют доступа к естественной морской воде. Сочетание в В. lanceolatum, удобного и надежного доступа к эмбрионам эффективного способа доставки, таких как микроинъекции, до сих пор единственным методом доставки разработаны в ланцетника (как Б. floridae и Б. belcheri) 13-15, будет способствовать развитию Роман набор манипулятивных техник, в том числе клонов tracing- и поведенческих подходов, основанных на динамический клеток.
Протокол для эффективного микроинъекции мРНК, чтобы выразить флуоресцентные белки в B. lanceolatum эмбрион, следовательно, разработан. Кроме того, для обеспечения базового инструментария для живого изображения В. эмбрионы lanceolatum, векторные системы были разработаны, которые позволяют ассоциированный с мембранами и ядерная выражение флуоресцентных белков. Для мембраны таргетинга, усиленный зеленый флуоресцентный белок (EGFP) был слит с коробкой человека HRAS CAAX и ядерной локализации mCherry и EGFP былополучены путем слияния с данио гистонов 2B (H2B) экзона (рис 1, дополнительном файле 1). Кроме того, с целью оптимизации трансляции белка, последовательности Козака и кодоны конструкций были изменены и приспособлены к использованию в В. lanceolatum. Взятые вместе, методом литья и векторы экспрессии, представленные здесь, служат в качестве основы для создания новых экспериментальных подходов к cephalochordates, в частности, анализ с использованием последней флуоресценции основе в технике естественных изображений.
Protocol
Representative Results
Discussion
В этой статье мы представляем, впервые, подробный и воспроизводимый протокол для инъекций В. lanceolatum ооциты, которые, после B. floridae 13,14 и B. belcheri 15, таким образом, что третий вид Amphioxus, для которых такой способ был описан. Важно отметить, что протокол, описанный здесь,…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы выразить признательность за поддержку со стороны "Animalerie центрального де Gif-сюр-Иветт" для животноводства. Эта работа была поддержана за счет средств ANR (ANR-09-BLAN-0262-02 и ANR-11-JSV2-002-01) с Майклом Шуберта, за счет гранта Европейского Союза 6РП "Embryomics" и грантом ANR "ANR- 10-BLAN-121801 Dev-Process "Жан-Франсуа Николя и Надин Peyriéras. João Emanuel Карвалью финансируется за счет исследовательских стипендий FCT (SFRH / BD / 86878/2012).
Заявки на векторы, описанные здесь могут быть адресованы непосредственно авторами.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Consumables | |||
| 35 mm Petri dishes | Falcon | 353001 | culture-treated |
| Filtration unit (Stericup 1L) | Fisher | W21719 | 0.22 micron filtration |
| Spin-X tubes | Costar | 8160 | 0.22 micron filtration tube |
| Needle storage jar for 1.2 mm diameter capillaries | WPI | E212 | |
| Pasteur Pipettes | 230 mm long | ||
| Aspiration tube | Dutscher | 75056 | |
| Capillaries for injection needles | Sutter | BF 120-94-10 | Borosilicate glass with filament, OD 1.20 mm, ID 0.94 mm, length 10 mm |
| Reagents | |||
| Low-melting agarose | SIGMA | A9414 | |
| Phenol Red | SIGMA | 114537 | |
| Glycerol | SIGMA | G2025 | |
| Poly-L-Lysine hydrobromide | SIGMA | P9155 | |
| H2O Dnase, Rnase-free | Gibco | 10977-035 | |
| mMessage mMachine SP6 Transcription kit | Ambion | AM1340 | mRNA synthesis kit |
| Phenol pH8 | SIGMA | P4557 | |
| 24:1 chloroform:isoamylic alcohol | SIGMA | C0549 | |
| 5:1 phenol pH4.7:chloroform | SIGMA | P1944 | |
| Reef Crystal salts (200 kg) | Europrix | Commercial salts | |
| Equipment | |||
| Fluorescent dissecting scope with 200x magnification | Leica | MZ16F | 25x oculars, DSR and GFP2 filters |
| Micromanipulator | Marzhauzer | M-33 | |
| Injector | Picospritzer | model II or III | |
| Needle puller | Sutter | P97 | heating-filament needle puller |
| Fine forceps | FINE SCIENCE TOOLS GMBH | 11252-30 | Dumont #5 |
References
- Weber, T., Köster, R. Genetic tools for multicolor imaging in zebrafish larvae. Methods. 62, 279-291 (2013).
- Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. Making the message clear: visualizing mRNA localization. Trends. Cell. Biol. 20, 380-390 (2010).
- Zhang, Y., Yu, L. C. Microinjection as a tool of mechanical delivery. Curr. Opin. Biotechnol. 19, 506-510 (2008).
- Stepicheva, N. A., Song, J. L. High throughput microinjections of sea urchin zygotes. J. Vis. Exp. , e50841 (2014).
- Schubert, M., Escriva, H., Xavier-Neto, J., Laudet, V. Amphioxus and tunicates as evolutionary model systems. Trends Ecol. Evol. 21, 269-277 (2006).
- Bertrand, S., Escriva, H. Evolutionary crossroads in developmental biology: amphioxus. Development. 138, 4819-4830 (2011).
- Holland, L. Z. Evolution of new characters after whole genome duplications: insights from amphioxus. Semin. Cell Dev. Biol. 24, 101-109 (2013).
- Lemaire, P. Evolutionary crossroads in developmental biology: the tunicates. Development. 138, 2143-2152 (2011).
- Yu, J. K., Holland, L. Z. Cephalochordates (amphioxus or lancelets): a model for understanding the evolution of chordate characters. Cold Spring Harbor Protocols. 2009, (2009).
- Fuentes, M., et al. Insights into spawning behavior and development of the European amphioxus (Branchiostoma lanceolatum). J. Exp. Zool. B. 308, 484-493 (2007).
- Li, G., Shu, Z., Wang, Y. Year-round reproduction and induced spawning of Chinese amphioxus, Branchiostoma belcheri, in laboratory. PLoS One. 8, e75461 (2013).
- Theodosiou, M., et al. Amphioxus spawning behavior in an artificial seawater facility. J. Exp. Zool. B. 316, 263-275 (2011).
- Holland, L. Z., Yu, J. K. Cephalochordate (amphioxus) embryos: procurement, culture, and basic methods. Methods Cell Biol. 74, 195-215 (2004).
- Holland, L. Z., Onai, T. Analyses of gene function in amphioxus embryos by microinjection of mRNAs and morpholino oligonucleotides. Methods Mol. Biol. 770, 423-438 (2011).
- Liu, X., Li, G., Feng, J., Yang, X., Wang, Y. Q. An efficient microinjection method for unfertilized eggs of Asian amphioxus Branchiostoma belcheri. Dev. Genes Evol. 223, 269-278 (2013).
- Harvey, K. J., Lukovic, D., Ucker, D. S. Membrane-targeted green fluorescent protein reliably and uniquely marks cells through apoptotic death. Cytometry. 43, 273-278 (2001).
- Maruyama, J., Nakajima, H., Kitamoto, K. Visualization of nuclei in Aspergillus oryzae with EGFP and analysis of the number of nuclei in each conidium by FACS. Biosci. Biotechnol. Biochem. 65, 1504-1510 (2001).
- Rupp, R. A., Snider, L., Weintraub, H. Xenopus embryos regulate the nuclear localization of XMyoD. Genes Dev. 8, 1311-1323 (1994).
- Turner, D. L., Weintraub, H. Expression of achaete-scute homolog 3 in Xenopus embryos converts ectodermal cells to a neural fate. Genes Dev. 8, 1434-1447 (1994).
- Nakagawa, S., Niimura, Y., Gojobori, T., Tanaka, H., Miura, K. Diversity of preferred nucleotide sequences around the translation initiation codon in eukaryote genomes. Nucleic Acids Res. 36, 861-871 (2008).
- Nakamura, Y., Gojobori, T., Ikemura, T. Codon usage tabulated from international DNA sequence databases: status for the year 2000. Nucleic Acids Res. 28, 292 (2000).
- Deheyn, D. D., et al. Endogenous green fluorescent protein (GFP) in amphioxus. Biol. Bull. 213, 95-100 (2007).
- Schubert, M., et al. Retinoic acid signaling acts via Hox1 to establish the posterior limit of the pharynx in the chordate amphioxus. Development. 132, 61-73 (2005).
- Schubert, M., Holland, N. D., Laudet, V., Holland, L. Z. A retinoic acid-Hox hierarchy controls both anterior/posterior patterning and neuronal specification in the developing central nervous system of the cephalochordate amphioxus. Dev. Biol. 296, 190-202 (2006).
- Yu, J. K., Holland, N. D., Holland, L. Z. Tissue-specific expression of FoxD reporter constructs in amphioxus embryos. Dev. Biol. 274, 452-461 (2004).
- Beaster-Jones, L., Schubert, M., Holland, L. Z. Cis-regulation of the amphioxus engrailed gene: insights into evolution of a muscle-specific enhancer. Mech. Dev. 124, 532-542 (2007).
- Holland, L. Z., et al. The amphioxus genome illuminates vertebrate origins and cephalochordate biology. Genome Res. 18, 1100-1111 (2008).
- Urasaki, A., Mito, T., Noji, S., Ueda, R., Kawakami, K. Transposition of the vertebrate Tol2 transposable element in Drosophila melanogaster. Gene. 425, 64-68 (2008).
- Li, G., et al. Mutagenesis at specific genomic loci of amphioxus Branchiostoma belcheri using TALEN method. J. Genet. Genomics. 41, 215-219 (2014).
- Zhang, Q. J., et al. Continuous culture of two lancelets and production of the second filial generations in the laboratory. J. Exp. Zool. B. 308, 464-472 (2007).
- Yasui, K., Igawa, T., Kaji, T., Henmi, Y. Stable aquaculture of the Japanese lancelet Branchiostoma japonicum for 7 years. J. Exp. Zool. B. 320, 538-547 (2013).
- Benito-Gutiérrez, E., Weber, H., Bryant, D. V., Arendt, D. Methods for generating year-round access to amphioxus in the laboratory. PLoS One. 8, e71599 (1371).
