ラット頸動脈における血管バルーン傷害と管腔内投与
Summary
このプロトコルは、ラット頚動脈上の管腔内損傷を引き起こすと今後新生内膜過形成を誘発するためにバルーンカテーテルを使用しています。これは、傷害に応答する脈管リモデリングのメカニズムを研究するための十分に確立されたモデルである。また、広く、潜在的な治療的アプローチの有効性を決定するために使用される。
Abstract
ラットでの頸動脈バルーン傷害モデルは、よく20年以上のために確立されている。それは、血管平滑筋分化、新生内膜形成および血管リモデリングに関与する分子や細胞メカニズムを研究するための重要な方法のまま。雄Sprague-Dawleyラットをこのモデルのために最も頻繁に用いられる動物である。女性ホルモンは血管疾患に対して保護的であり、したがって、このプロシージャにバリエーションを導入として雌ラットは好ましくない。左頸動脈は、一般的に、陰性対照として右の頸動脈に怪我をされている。左頸動損傷は、内皮をdenudesとs血管壁を膨張させる膨張したバルーンによって引き起こされる。損傷後、そのような薬理学的化合物および遺伝子またはshRNA転送のいずれかの使用のような潜在的な治療戦略を評価することができる。典型的には遺伝子またはshRNA転送のため、血管内腔の負傷した部分が局所的にvで30分間形質導入され損傷した血管壁の送達および発現のためのタンパク質またはshRNAのいずれかをコードするIRAL粒子。増殖性血管平滑筋細胞を表す新生内膜肥厚は、通常、損傷後2週間でピーク。容器は、主に細胞および分子細胞シグナル伝達経路の解析、並びに遺伝子及びタンパク質発現のために、この時点で収穫される。容器はまた、意図された実験の目的に応じて、特定のタンパク質または経路の発現及び/又は活性化の開始を決定するために、以前の時点で収穫することができる。容器は、組織学的染色、免疫組織化学、タンパク質/ mRNAのアッセイ、および活性アッセイを用いて特徴付けし、評価することができる。同じ動物からの無傷の右頸動脈は理想内部対照である。分子および細胞パラメータにおける傷害誘導変化は、内部右側対照動脈に損傷動脈を比較することによって評価することができる。同様に、治療法は傷を負う比較することによって評価することができますコントロールにDと治療動脈は唯一の動脈を負傷した。
Introduction
バルーンカテーテルは、血管内のアテロームまたは血栓閉塞部位を広げる目的で、血管形成術の手順で使用する医療機器である。狭め血管内腔は、膨張バルーンによって開くように強制され、血液供給は、狭心症、心筋梗塞、および下肢痛のような下流の虚血症状を緩和するために連続的に復元される。それにもかかわらず、血管形成術の大成功は、そのような血管内腔（再狭窄）1の再狭小血管気圧外傷（バルーン損傷）、すなわち血管壁リモデリングを引き起こす力の結果として、多くの場合、術後の合併症によって減少されました。
多くの動物モデルは、研究者は、バルーン損傷に関連する血管壁リモデリング2のメカニズムを理解するための血管形成術を模倣開発されてきた。モデリングのために利用されるすべての動物種の中では、ラットは、最も頻繁にものを用いられる。 ℃ウサギ、イヌおよびブタにompared、ラットの利点は、その低コスト、使用が比較的容易とラットの生理学の現在の知識である。マウスは、遺伝子操作株の広い範囲で追加の利点を有するが、マウスの血管は、バルーンカテーテルを挿入するには小さすぎる。過去30年間にわたり、実験ラットは、研究者が3-6を改造新生内膜形成と血管を支える分子·細胞メカニズムのより良い理解を得ることができました。バルーン傷害を越え、血管リモデリングはまた、アテローム性動脈硬化症7,8、高血圧9、及び動脈瘤10などのほとんどの主要な血管疾患に関与している。このように、知識は、バルーン傷害モデルを通して得、一般に、全体的な血管壁の疾患の研究に有益である。
ラットバルーン傷害モデルの全体的な目標は、だけでなく、さらに血管疾患を理解するだけでなく、のための新規薬剤の効力を試験することである疾病コントロール11,12。再狭窄の現在の臨床薬物治療は、右血管形成術後の血管内腔を介して配置された薬剤溶出ステントにより適用される。動物モデルでは、新しいエージェント·テストのための効率がさらに経済的な方法は十分に開発されたローカル腔内灌流法である。候補このメソッドを使ってテストされている薬剤の小分子薬を含んで13,14、サイトカインまたは成長は15,16因子 、薬剤を操作する遺伝子（cDNAクローンは、siRNA など ） を 17-20、及び新規な医薬製剤21,22。
これまでに、ラットバルーン傷害モデルは、血管疾患/障害を研究するための最も有用なモデルの一つである。それは、最初のステップは、in vivoでのin vitroでの移動は、通常のように、ベンチからベッドサイドへの基本的なステップですが、それは最後の1であってはならない。ラットの実験の結果は、審議し、さらに人間への変換の前に特徴付けされる必要があるによる血管床および血管の解剖学的構造ならびにヒトおよびラットの23〜26との間の本質的な種差の差に臨床使用。それにもかかわらず、それはまだ翻訳医学研究に不可欠なツールである。このような研究は、遺伝的に改変されたラットの欠如によって制限されるために使用されるが、このようなジンクフィンガーとしての新規なゲノムアプローチは29ノックアウトラットを簡単にアクセスできるようにしている、27ヌクレアーゼTALENs 28およびCRISPR-Casのため、それはもはや問題ではなかった。
Protocol
Representative Results
Discussion
ラット頸動脈バルーン損傷はよく2007 34 Tulisによって記載されている。それは、包括的に博士Tulisこの手順のすべての詳細を説明してきた。この手順を実行するに興味がある読者は非常にTulis 'プロトコルを読むことをお勧めします。しかし、我々は博士Tulisに同意していない一つのことがあります：代わりに生理食塩水または液体のいずれかの種類でバルーンを膨張させるのが、私たちは空気でそ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We are grateful to Dr. Clowes for first developing and describing this method. We are also thankful to Dr. Tulis for his detailed protocol which has been fundamentally helpful to our previous, current and future work. This work was supported by grants R01HL097111 and R01HL123364 from the NIH to M.T., and by American Heart Association grant 14GRNT18880008 to M.T.
We would like to thank Rachel Newton for her expert technical support and for her valuable help during the filming process.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Fogarty balloon embolectomy catheters, 2 French | Edwards Lifesciences, Germany | 120602F | |
| Deltaphase Operating Board – Includes 2 Pads & 2 Insulators | Braintree Scientific, Inc. | 39OP | |
| LED light source | Fisher Scientific | 12-563-501 | |
| Hartmann Mosquito Forceps 4” curved | Apiary Medical, Inc. San Diego, CA | gS 22.1670 | |
| Crile Retractor 4” double ended | Apiary Medical, Inc. | gS 34.1934 | |
| Other surgical instruments | Roboz Surgical Instrument Company, Inc., Gaithersburg, MD | ||
| Peripheral Intravenous (I.V.) Cannula, 24G | BD | 381312 | |
| Ketamine HCl, 100mg/mL, 10mL | Ketaset- Patterson Vet | 07-803-6637 | |
| Xylazine (AnaSed),20mg/mL,20mL | Ketaset- Patterson Vet | 07-808-1947 | |
| Buprenex, 0.3mg/1ml (5 Ampules/Box) | Ketaset- Patterson Vet | 07-850-2280 | |
| Nair Baby Oil Hair Removal Lotion-9 oz | Amazon/Walmart/CVS | N/A | |
| Inflation Device | Demax Medical | DID30 | |
| D300 3-way Stopcock | B.Braun Medical Inc. | 4599543 | |
| Artificial Tears Ointment | Rugby Laboratories, Duluth, GA | N/A |
References
- Landzberg, B. R., Frishman, W. H., Lerrick, K. Pathophysiology and pharmacological approaches for prevention of coronary artery restenosis following coronary artery balloon angioplasty and related procedures. Progress in Cardiovascular Diseases. 39, 361-398 (1997).
- Muller, D. W., Ellis, S. G., Topol, E. J. Experimental models of coronary artery restenosis. J. Am. Coll. Cardiol. 19, 418-432 (1992).
- Clowes, A. W., Reidy, M. A., Clowes, M. M. Kinetics of cellular proliferation after arterial injury. I. Smooth muscle growth in the absence of endothelium. Laboratory Investigation: A Journal of Technical Methods and Pathology. 49, 327-333 (1983).
- Clowes, A. W., Reidy, M. A., Clowes, M. M. Mechanisms of stenosis after arterial injury. Laboratory Investigation: A Journal of Technical Methods and Pathology. 49, 208-215 (1983).
- Clowes, A. W., Clowes, M. M. Kinetics of cellular proliferation after arterial injury. IV. Heparin inhibits rat smooth muscle mitogenesis and migration. Circulation Research. 58, 839-845 (1986).
- Li, G., Chen, S. J., Oparil, S., Chen, Y. F., Thompson, J. A. Direct in vivo evidence demonstrating neointimal migration of adventitial fibroblasts after balloon injury of rat carotid arteries. Circulation. 101, 1362-1365 (2000).
- Kiechl, S., Willeit, J. The natural course of atherosclerosis. Part II: vascular remodeling. Bruneck Study Group. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 19, 1491-1498 (1999).
- Yamamoto, S., et al. Derivation of rat embryonic stem cells and generation of protease-activated receptor-2 knockout rats. Transgenic Research. 21, 743-755 (2012).
- Intengan, H. D., Schiffrin, E. L. Vascular remodeling in hypertension: roles of apoptosis, inflammation, and fibrosis. Hypertension. 38, 581-587 (2001).
- Meng, H., et al. Complex hemodynamics at the apex of an arterial bifurcation induces vascular remodeling resembling cerebral aneurysm initiation. Stroke. 38, 1924-1931 (2007).
- Sun, C. K., Shao, P. L., Wang, C. J., Yip, H. K. Study of vascular injuries using endothelial denudation model and the therapeutic application of shock wave: a review. American Journal of Rranslational Research. 3, 259-268 (2011).
- Zhang, W., et al. Orai1-mediated I (CRAC) is essential for neointima formation after vascular injury. Circulation Research. 109, 534-542 (2011).
- Ollinger, R., et al. Bilirubin: a natural inhibitor of vascular smooth muscle cell proliferation. Circulation. 112, 1030-1039 (2005).
- Levitzki, A. PDGF receptor kinase inhibitors for the treatment of restenosis. Cardiovascular Research. 65, 581-586 (2005).
- Asahara, T., et al. Local delivery of vascular endothelial growth factor accelerates reendothelialization and attenuates intimal hyperplasia in balloon-injured rat carotid artery. Circulation. 91, 2793-2801 (1995).
- Lee, K. M., et al. Alpha-lipoic acid inhibits fractalkine expression and prevents neointimal hyperplasia after balloon injury in rat carotid artery. Atherosclerosis. 189, 106-114 (2006).
- Ji, R., et al. MicroRNA expression signature and antisense-mediated depletion reveal an essential role of MicroRNA in vascular neointimal lesion formation. Circulation Research. 100, 1579-1588 (2007).
- Merlet, E., et al. miR-424/322 regulates vascular smooth muscle cell phenotype and neointimal formation in the rat. Cardiovascular Research. 98, 458-468 (2013).
- Huang, J., Niu, X. L., Pippen, A. M., Annex, B. H., Kontos, C. D. Adenovirus-mediated intraarterial delivery of PTEN inhibits neointimal hyperplasia. Arteriosclerosis, Thrombosis, And Vascular Biology. 25, 354-358 (2005).
- Gonzalez-Cobos, J. C., et al. Store-independent Orai1/3 channels activated by intracrine leukotriene C4: role in neointimal hyperplasia. Circulation Research. 112, 1013-1025 (2013).
- Guzman, L. A., et al. Local intraluminal infusion of biodegradable polymeric nanoparticles. A novel approach for prolonged drug delivery after balloon angioplasty. Circulation. 94, 1441-1448 (1996).
- Lipke, E. A., West, J. L. Localized delivery of nitric oxide from hydrogels inhibits neointima formation in a rat carotid balloon injury model. Acta Biomaterialia. 1, 597-606 (2005).
- Osterrieder, W., et al. Role of angiotensin II in injury-induced neointima formation in rats. Hypertension. 18, II60-II64 (1991).
- Powell, J. S., et al. Inhibitors of angiotensin-converting enzyme prevent myointimal proliferation after vascular injury. Science. 245, 186-188 (1989).
- . Does the new angiotensin converting enzyme inhibitor cilazapril prevent restenosis after percutaneous transluminal coronary angioplasty? Results of the MERCATOR study: a multicenter, randomized, double-blind placebo-controlled trial. Multicenter European Research Trial with Cilazapril after Angioplasty to Prevent Transluminal Coronary Obstruction and Restenosis (MERCATOR) Study Group. Circulation. 86, 100-110 (1992).
- Faxon, D. P. Effect of high dose angiotensin-converting enzyme inhibition on restenosis: final results of the MARCATOR Study, a multicenter, double-blind, placebo-controlled trial of cilazapril. The Multicenter American Research Trial With Cilazapril After Angioplasty to Prevent Transluminal Coronary Obstruction and Restenosis (MARCATOR) Study Group. J Am Coll Cardiol. 25, 362-369 (1995).
- Geurts, A. M., et al. Knockout rats via embryo microinjection of zinc-finger nucleases. Science. 325, 433 (2009).
- Tesson, L., et al. Knockout rats generated by embryo microinjection of TALENs. Nature Biotechnology. 29, 695-696 (2011).
- Li, D., et al. Heritable gene targeting in the mouse and rat using a CRISPR-Cas system. Nature Biotechnology. 31, 681-683 (2013).
- Potier, M., et al. Evidence for STIM1- and Orai1-dependent store-operated calcium influx through ICRAC in vascular smooth muscle cells: role in proliferation and migration. FASEB Journal : Official Publication Of The Federation Of American Societies For Experimental Biology. 23, 2425-2437 (2009).
- Aubart, F. C., et al. RNA interference targeting STIM1 suppresses vascular smooth muscle cell proliferation and neointima formation in the rat. Molecular Therapy. The Journal Of The American Society Of Gene Therapy. 17, 455-462 (2009).
- Berra-Romani, R., Mazzocco-Spezzia, A., Pulina, M. V., Golovina, V. A. Ca2+ handling is altered when arterial myocytes progress from a contractile to a proliferative phenotype in culture. American journal of physiology. Cell Physiology. 295, C779-C790 (2008).
- Bisaillon, J. M., et al. Essential role for STIM1/Orai1-mediated calcium influx in PDGF-induced smooth muscle migration. American journal of physiology. Cell Physiology. 298, C993-C1005 (2010).
- Tulis, D. A. Rat carotid artery balloon injury model. Methods In Molecular Medicine. 139, 1-30 (2007).
- Zhang, W., Trebak, M., Szallasi, A., Bíró, T. Balloon Injury in Rats as a Model for Studying TRP Channel Contribution to Vascular Smooth Muscle Remodeling. T TRP Channels in Drug DiscoveryMethods in Pharmacology and Toxicology. , 101-111 (2012).
- Tulis, D. A. Histological and morphometric analyses for rat carotid balloon injury model). Methods In Molecular Medicine. 139, 31-66 (2007).
