خيارات نيون<em> في الموقع</em> بروتوكول التهجين لXist RNA جنبا إلى جنب مع المناعي من هيستون تعديل في كروموسوم X-التعطيل
Summary
We developed an easily customized strand-specific fluorescent in situ hybridization (FISH) protocol combined with immunofluorescence. This allows for a detailed examination of RNA dynamics with simultaneous insight into the chromatin structure, nuclear organization, and transcriptional regulation at the single cell level.
Abstract
الجمع بين RNA فلوري التهجين في الموقع (FISH) مع المناعي (المناعية FISH) في يخلق التقنية التي يمكن استخدامها على مستوى خلية واحدة للكشف عن ديناميات المكانية للتوطين RNA مع البصيرة في وقت واحد في توطين البروتينات أو تعديلات جينية وغيرها من التفاصيل والتي يمكن التي أبرزها المناعي. X-كروموسوم تعطيل هو نموذج لفترة طويلة غير المشفر RNA (lncRNA) بوساطة إسكات الجينات. -X غير نشط نص معين (Xist) تراكم lncRNA (وتسمى سحابة Xist) على واحد من اثنين X-الكروموسومات في الإناث الثدييات هو خطوة حاسمة لبدء كروموسوم X-تعطيل. Xist RNA يتفاعل مباشرة أو غير مباشرة مع مختلف الانزيمات تعديل الكروماتين ويقدم المناظر الطبيعية جينية مميزة لغير نشط X-كروموسوم (شي). واحد السمة المميزة جينية معروف من شي هي هيستون H3 ثلاثي ميثيل يسين 27 (H3K27me3) التعديل. هنا، نحن تصف المناعية FISH بسيطة وسريعةبروتوكول للكشف عن Xist RNA باستخدام RNA FISH مع تحقيقات قليل النوكليوتيد متعددة إلى جانب المناعي من H3K27me3 لدراسة توطين Xist RNA وتعديلات جينية المرتبطة بها. استخدام نتائج تحقيقات قليل النوكليوتيد في فترة حضانة أقصر والكشف عن أكثر حساسية من Xist RNA مقارنة في المختبر كتب تحقيقات RNA (riboprobes). يوفر هذا البروتوكول أداة قوية لفهم ديناميات lncRNAs وما يرتبط بها من تعديله جينية، هيكل الكروماتين، والتنظيم النووية وتنظيم النسخي.
Introduction
الثدييات X-كروموسوم تعطيل (XCI) هو استراتيجية للتعويض عن الخلل في العاشر مرتبطة جرعة الجينات بين XX XY و، حيث واحد من اثنين X-الكروموسومات في الإناث هو transcriptionally المعطل 1. X-كروموسوم تعطيل هو نظام نموذج رائع لفترة طويلة RNA غير المشفر (lncRNA) البحوث. وينظم X-كروموسوم تعطيل من قبل lncRNAs متعددة، وتمت دراسة على نطاق واسع على مدى العقود القليلة الماضية لكشف آليات الحديث المتبادل بين lncRNAs، النسخ، هيكل الكروماتين وتنظيم النووية 2 و 3.
مركز X تعطيل (XIC) تقع على الصبغي X-هو موضع الجيني معقدة تتألف من عدد من الجينات إنتاج الرنا غير الترميز 4. -X غير نشط نص معين (Xist) lncRNA في الثدييات eutherian هو واحد من هذا القبيل lncRNA التي تلعب دورا حاسما في كروموسوم X-تعطيل 5،6. النصوص Xist تحيط موقع فوالبنية شي لبدء كروموسوم X-تعطيل، وتبدو وكأنها سحابة عندما تصور باستخدام RNA FISH. ويشار إلى هذا التشكيل ب "Xist الغيمة" 7. منذ Xist RNA يتفاعل مع مختلف الانزيمات تعديل الكروماتين، ويلاحظ شارك في توطين الغيوم Xist مع تعديلات جينية مختلفة لونين الصمت والنسخ القمعي خلال كروموسوم X-تعطيل 8. على سبيل المثال، يتفاعل Xist RNA مع polycomb مجمع القمعي 2 (PRC2) وهي المسؤولة عن H3K27me3 وتفضي إلى حالة لونين القمعية 9. وقوع سحابة Xist على زيان والتي تشترك في التعريب مع تعديل H3K27me3 المكثف يمثل المشهد المغاير الاختياري للشي 10،11.
وتأتي التقنيات الوراثية الخلوية، مثل DNA / RNA FISH شوطا طويلا من الطريقة التقليدية باستخدام تحقيقات radiolabelled 12 إلى التقنيات الحديثة والمتقدمة مع تعزيز الحساسية والتصوير الفلورسنت باستخدام المجسات قليل النوكليوتيد متعددة 13،14. FISH DNA / RNA إلى جانب المناعي وقد استخدم بشكل روتيني كأداة الخلوي لفهم تنظيم الزمانية المكانية النووية، RNA الترجمة، وهيكل الكروماتين والتعديلات. إعداد التحقيق الأكثر القياسي لRNA FISH ينطوي على استخدام البلازميد أو البكتيرية الصبغي الاصطناعي (BAC) استنساخ ووضع العلامات لاحقا إما مع الترجمة نيك أو فتيلة العشوائي 15. ومع ذلك، ما يقرب من 70٪ من الجينات في الفئران و 40٪ من الجينات في البشر تظهر تداخل الحس والعقاقير النصوص 16، وبالتالي تتطلب طريقة FISH حبلا محددة من أجل التمييز الشعور والعقاقير النصوص. في المختبر تحقيقات RNA كتب (riboprobe ) غالبا ما تستخدم لحبلا محددة RNA FISH 17،18. ومع ذلك، وهذا ينطوي إعداد استنساخ البلازميد أو منتج PCR مع T7، SP6 أو T3 المروج وriboprobes تجميع. وعلاوة على ذلك، riboprobes المستمدة من genomجيم DNA أو كدنا] غالبا ما تحتوي على مناطق غير محددة والعناصر المتكررة، مما يؤدي إلى ارتفاع الضوضاء في الخلفية. وثمة مسألة أخرى هي أن riboprobes، والتي هي بضع مئات من النيوكليوتيدات في الطول واحتواء fluorophores متعددة، لا يمكن أن تخترق بفاعلية في النواة. للتحايل على هذا، تم وضع عدة تحقيقات قليل النوكليوتيد أقصر المسمى مع fluorophore واحد في نهاية التي لديها حساسية جيدة، وقوة الإشارة موحدة، وسهولة تنقية ومعالجة 14. وبالإضافة إلى ذلك، [أليغنوكليوتيد DNA عادة ما تكون أكثر استقرارا من الحمض النووي الريبي. طبقنا استراتيجية مماثلة باستخدام [أليغنوكليوتيد في Xist RNA FISH 19 مع المناعي لفهم ديناميات جينية من شي الناجمة عن Xist lncRNA خلال عملية كروموسوم X-تعطيل. يصف هذا البروتوكول خلق تحقيقات قليل النوكليوتيد والإعداد المناسب من الخلايا، وكذلك الاستفادة من RNA المناعي وFISH. Xist RNA FISH باستخدام oligonucle متعددةotides هو نهج فعال من حيث التكلفة في المدى الطويل إذا يتم تنفيذ Xist RNA FISH بشكل روتيني في مختبر واحد. ويمكن استخدام هذه التقنية لتحديد lncRNAs في الخلايا في حين رسم في وقت واحد شارك في التعريب مع تعديلات جينية أو عوامل. واحد الميزة الرئيسية لبروتوكول هي القدرة على تعديله بسهولة لتناسب مصالح المرء البحوث.
Protocol
Representative Results
Discussion
في هذه الورقة، قدمنا سريع بروتوكول المناعية FISH أن يستغرق أقل من 5 ساعة لاستكمال إعداد الشرائح، Xist RNA FISH، والمناعي للH3K27me3. وبالمقارنة مع النهج المناعية FISH العام لXist RNA الكشف، الذي يحتاج عادة الحضانة بين عشية وضحاها RNA FISH، هذا البروتوكول ليس فقط يخفف كثيرا من الوقت ال…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Hongjae Sunwoo for helpful advice for oligonucleotide design in RNA FISH. We also thank Serenity Curtis for editing the manuscript. N.Y. was supported by a Postdoctoral Fellowship for Research Abroad of the Japan Society for the Promotion of Science (JSPS). This work was supported by the NIH (RO1-GM102184), the March of Dimes Research Foundation (#6-FY12-337), and the Developmental Fund and Trustee Grant at Cincinnati Children’s Hospital Medical Center to Y.O.
Materials
| oligonucleotides with 5’-amine modification | IDT | |
| Alexa Fluor 488 Reactive Dye | Life Technologies | A32750 |
| MicroSpin G-25 columns | GE Healthcare | 27-5325-01 |
| Cytospin 2 | Shandon | 59900102 |
| Bovine Serum Albumin, Molecular Biology Grade (for hybridization buffer) | Roche | 10715859103 |
| Histone H3K27me3 antibody | Active Motif | 61017 |
| Accutase | Innovative Cell Technologies | AT104 |
| Alexa Fluor 555 Goat Anti-Mouse, highly cross-adsorbed | Life Technologies | A21424 |
| ProLong Gold antifade reagent | Life Technologies | P36931 |
References
- Payer, B., Lee, J. T. X chromosome dosage compensation: how mammals keep the balance. Annu Rev Genet. 42, 733-772 (2008).
- Lee, J. T. Gracefully ageing at 50, X-chromosome inactivation becomes a paradigm for RNA and chromatin control. Nat Rev Mol Cell Biol. 12, 815-826 (2011).
- Gendrel, A. V., Heard, E. Fifty years of X-inactivation research. Development. 138, 5049-5055 (2011).
- Froberg, J. E., Yang, L., Lee, J. T. Guided by RNAs: X-inactivation as a model for lncRNA function. J Mol Biol. 425, 3698-3706 (2013).
- Penny, G. D., Kay, G. F., Sheardown, S. A., Rastan, S., Brockdorff, N. Requirement for Xist in X chromosome inactivation. Nature. 379, 131-137 (1996).
- Marahrens, Y., Panning, B., Dausman, J., Strauss, W., Jaenisch, R. Xist-deficient mice are defective in dosage compensation but not spermatogenesis. Genes Dev. 11, 156-166 (1997).
- Clemson, C. M., McNeil, J. A., Willard, H. F., Lawrence, J. B. XIST RNA paints the inactive X chromosome at interphase: evidence for a novel RNA involved in nuclear/chromosome structure. J Cell Biol. 132, 259-275 (1996).
- Sado, T., Brockdorff, N. Advances in understanding chromosome silencing by the long non-coding RNA. Xist. Phil Trans R Soc B. 368, 20110325-20 (2013).
- Zhao, J., Sun, B. K., Erwin, J. A., Song, J. J., Lee, J. T. Polycomb proteins targeted by a short repeat RNA to the mouse X chromosome. Science. 322, 750-756 (2008).
- Plath, K., et al. Role of histone H3 lysine 27 methylation in X inactivation. Science. 300, 131-135 (2003).
- Silva, J., et al. Establishment of histone h3 methylation on the inactive X chromosome requires transient recruitment of Eed-Enx1 polycomb group complexes. Dev Cell. 4, 481-495 (2003).
- Gall, J. G. Differential synthesis of the genes for ribosomal RNA during amphibian oogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 60, 553-560 (1968).
- Femino, A. M., Fay, F. S., Fogarty, K., Singer, R. H. Visualization of single RNA transcripts in situ. Science. 280, 585-590 (1998).
- Raj, A., van den Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes. Nat Methods. 5, 877-879 (2008).
- Chaumeil, J., Augui, S., Chow, J. C., Heard, E. Combined immunofluorescence, RNA fluorescent in situ hybridization, and DNA fluorescent in situ hybridization to study chromatin changes, transcriptional activity, nuclear organization, and X-chromosome inactivation. Methods Mol Biol. 463, 297-308 (2008).
- Katayama, S., et al. Antisense transcription in the mammalian transcriptome. Science. 309, 1564-1566 (2005).
- Ogawa, Y., Xite Lee, J. T. X-inactivation intergenic transcription elements that regulate the probability of choice. Mol Cell. 11, 731-743 (2003).
- Panning, B. X inactivation in mouse ES cells: histone modifications and FISH. Methods Enzymol. 376, 419-428 (2004).
- Khalil, A. M., et al. Many human large intergenic noncoding RNAs associate with chromatin-modifying complexes and affect gene expression. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 11667-11672 (2009).
- Martin, G. R., Evans, M. J. Differentiation of clonal lines of teratocarcinoma cells: formation of embryoid bodies in vitro. Proc Natl Acad Sci U S A. 72, 1441-1445 (1975).
- Lee, J. T., Lu, N. Targeted mutagenesis of Tsix leads to nonrandom X inactivation. Cell. 99, 47-57 (1999).
- Zhang, L. F., et al. Telomeric RNAs mark sex chromosomes in stem cells. 유전학. 182, 685-698 (2009).
- Raj, A., Tyagi, S. Detection of individual endogenous RNA transcripts in situ using multiple singly labeled probes. Methods Enzymol. 472, 365-386 (2010).
- Kimura, H., Hayashi-Takanaka, Y., Goto, Y., Takizawa, N., Nozaki, N. The organization of histone H3 modifications as revealed by a panel of specific monoclonal antibodies. Cell Struct Funct. 33, 61-73 (2008).
- Ogawa, Y., Sun, B. K., Lee, J. T. Intersection of the RNA interference and X-inactivation pathways. Science. 320, 1336-1341 (2008).
- Kohlmaier, A., et al. A chromosomal memory triggered by Xist regulates histone methylation in X inactivation. PLoS Biol. 2, 171 (2004).
- Wang, K. C., Chang, H. Y. Molecular mechanisms of long noncoding RNAs. Mol Cell. 43, 904-914 (2011).
