Snel Fluorescent<em> In Situ</em> Hybridisatie Protocol voor Xist RNA gecombineerd met Immuunfluorescentie van histon-eiwitten in het X-chromosoom inactivatie
Summary
We developed an easily customized strand-specific fluorescent in situ hybridization (FISH) protocol combined with immunofluorescence. This allows for a detailed examination of RNA dynamics with simultaneous insight into the chromatin structure, nuclear organization, and transcriptional regulation at the single cell level.
Abstract
Combineren RNA fluorescente in situ hybridisatie (FISH) met immunofluorescentie (immuno-FISH) maakt een techniek die kan worden toegepast bij de enkele cel niveau om de ruimtelijke dynamiek van RNA lokalisatie met gelijktijdige inzicht detecteren in de lokalisatie van eiwitten, epigenetische veranderingen en andere details die kan worden benadrukt door immunofluorescentie. X-chromosoom inactivatie is een paradigma voor lange niet-coderende RNA (lncRNA) gemedieerde silencing. X-inactief specifieke transcript (Xist) lncRNA accumulatie (genoemd Xist cloud) op één van de twee X-chromosomen in zoogdiercellen vrouwen is een kritieke stap voor X-chromosoom inactivatie initiëren. Xist RNA direct of indirect in wisselwerking met diverse chromatine-modificerende enzymen en introduceert verschillende epigenetische landschappen tot het inactieve X-chromosoom (Xi). Een bekende epigenetische kenmerk van de Xi is de histon H3 trimethyl-lysine 27 (H3K27me3) wijziging. Hier wordt een eenvoudige en snelle immuno-FISH beschrijven weprotocol voor het opsporen Xist RNA met behulp van RNA FISH met meerdere oligonucleotidenprobes combinatie met immunofluorescentie van H3K27me3 om de lokalisatie van Xist RNA en bijbehorende epigenetische veranderingen te onderzoeken. Met oligonucleotide probes resulteert in een kortere incubatietijd en gevoeligere detectie van Xist RNA vergeleken met in vitro getranscribeerd RNA probes (riboprobes). Dit protocol biedt een krachtige tool voor het begrijpen van de dynamiek van lncRNAs en de bijbehorende epigenetische modificatie, chromatine structuur, nucleaire organisatie en transcriptionele regulatie.
Introduction
Zoogdier X-chromosoom inactivatie (XCI) een strategie ter compensatie van de onbalans in X-gebonden gen doseringen XX en XY, waarbij één van de twee X-chromosomen bij vrouwen transcriptioneel geïnactiveerd 1. X-chromosoom inactivatie is een geweldige modelsysteem voor lange niet-coderende RNA (lncRNA) onderzoek. X-chromosoom inactivatie wordt geregeld op verschillende lncRNAs, en is uitgebreid bestudeerd in de afgelopen decennia om de overspraak mechanismen tussen lncRNAs, transcriptie, chromatine structuur en nucleaire organisatie 2, 3 ontdekken.
De X inactivatie centrum (XIC) op het X-chromosoom is een complexe genetische locus bestaat uit een aantal genen die niet-coderende RNA's 4. X-inactief specifieke transcript (Xist) lncRNA in eutherian zoogdieren is een dergelijke lncRNA die een cruciale rol in X-chromosoom inactivatie 5,6 speelt. Xist transcripties rondom de locatie van de futuur Xi aan X-chromosoom inactivatie initiëren, en verschijnen als een wolk bij gevisualiseerd met behulp van RNA FISH; Deze informatie is aangeduid als de "Xist Wolk" 7. Sinds Xist RNA interageert met verschillende chromatine-modificerende enzymen, is co-lokalisatie van de Xist wolken met verschillende epigenetische modificaties voor een stille chromatine en repressieve transcriptie waargenomen tijdens X-chromosoom inactivatie 8. Bijvoorbeeld, Xist RNA wisselwerking met polycomb repressieve complexe 2 (PRC2) die verantwoordelijk is voor H3K27me3 en induceert een repressieve chromatine staat 9. Het optreden van de Xist wolk op de Xi en zijn co-lokalisatie met de intensieve H3K27me3 wijziging een facultatieve heterochromatine landschap van de Xi 10,11.
Cytogenetische technieken, zoals DNA / RNA FISH hebben een lange weg van de traditionele methode met behulp speurstoffen 12 tot recente en geavanceerde technieken met verbeterde gevoeligheid enfluorescente beeldvorming met meerdere oligonucleotideprobes 13,14. DNA / RNA FISH combinatie met immunofluorescentie werd routinematig gebruikt als een instrument om cytologische spatiotemporele nucleaire organisatie, RNA lokalisatie, chromatinestructuur en modificaties begrijpen. De meeste standaard probe voorbereiding voor RNA FISH omvat het gebruik van plasmide of bacteriële kunstmatige chromosoom (BAC) klonen en hun verdere kenmerken hetzij nick-translatie of willekeurige priming 15. Echter, bijna 70% van de genen in muizen en 40% van genen bij de mens een overlap vertonen van sense en antisense transcripten 16, waardoor het met een strengs specifieke FISH methode om sense en antisense transcripten onderscheiden. In vitro getranscribeerde RNA probes (riboprobe ) worden vaak gebruikt voor strengs specifieke RNA FISH 17,18; echter, gaat het bereiden van een plasmide kloon of PCR product met T7, SP6 of T3-promotor en synthetiseren riboprobes. Bovendien riboprobes ontleend genomic DNA of cDNA bevatten vaak aspecifiek gebieden en repetitieve elementen, die resulteren in hoge achtergrondruis. Een ander probleem is dat riboprobes, die enkele honderden nucleotiden lang en bevatten meerdere fluoroforen, niet efficiënt kunnen doordringen in de kern. Om dit te omzeilen, hebben meerdere kortere oligonucleotide probes gelabeld met een fluorofoor aan het einde ontwikkeld die goede gevoeligheid, uniform signaalsterkte en gemak van zuivering en behandeling 14 hebben. Daarnaast DNA oligonucleotiden algemeen stabieler dan RNA. We pasten een soortgelijke strategie waarbij oligonucleotiden Xist RNA FISH 19 met immunofluorescentie de epigenetische dynamiek van de Xi geïnduceerd door Xist lncRNA tijdens het X-chromosoom inactivatie begrijpen. Dit protocol wordt het maken van oligonucleotideprobes en goede voorbereiding van cellen, alsook het gebruik van immunofluorescentie en RNA FISH. Xist RNA FISH gebruik van meerdere oligonucleotides is goedkopere wijze op de lange termijn als Xist RNA FISH routinematig uitgevoerd in een laboratorium. Deze techniek kan worden gebruikt om cellen te identificeren lncRNAs in kaart brengen en tegelijkertijd de co-lokalisatie met epigenetische veranderingen of factoren. Een groot voordeel van het protocol is de mogelijkheid om gemakkelijk passen een onderzoek interesses.
Protocol
Representative Results
Discussion
In dit artikel hebben we een snelle immuno-FISH protocol dat minder dan 5 uur duurt om dia voorbereiding, Xist RNA FISH, en immunofluorescentie voor H3K27me3 voltooien gepresenteerd. In vergelijking met de algemene immuno-FISH aanpak Xist RNA detectie, die meestal nodig overnacht incuberen RNA FISH dit protocol niet alleen aanzienlijk minder tijd, maar verbetert ook de gevoeligheid van immuun-FISH gebruik van oligonucleotide probes.
Aangezien Xist wordt sterk getranscribeerd in X-chromosoom …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Hongjae Sunwoo for helpful advice for oligonucleotide design in RNA FISH. We also thank Serenity Curtis for editing the manuscript. N.Y. was supported by a Postdoctoral Fellowship for Research Abroad of the Japan Society for the Promotion of Science (JSPS). This work was supported by the NIH (RO1-GM102184), the March of Dimes Research Foundation (#6-FY12-337), and the Developmental Fund and Trustee Grant at Cincinnati Children’s Hospital Medical Center to Y.O.
Materials
| oligonucleotides with 5’-amine modification | IDT | |
| Alexa Fluor 488 Reactive Dye | Life Technologies | A32750 |
| MicroSpin G-25 columns | GE Healthcare | 27-5325-01 |
| Cytospin 2 | Shandon | 59900102 |
| Bovine Serum Albumin, Molecular Biology Grade (for hybridization buffer) | Roche | 10715859103 |
| Histone H3K27me3 antibody | Active Motif | 61017 |
| Accutase | Innovative Cell Technologies | AT104 |
| Alexa Fluor 555 Goat Anti-Mouse, highly cross-adsorbed | Life Technologies | A21424 |
| ProLong Gold antifade reagent | Life Technologies | P36931 |
References
- Payer, B., Lee, J. T. X chromosome dosage compensation: how mammals keep the balance. Annu Rev Genet. 42, 733-772 (2008).
- Lee, J. T. Gracefully ageing at 50, X-chromosome inactivation becomes a paradigm for RNA and chromatin control. Nat Rev Mol Cell Biol. 12, 815-826 (2011).
- Gendrel, A. V., Heard, E. Fifty years of X-inactivation research. Development. 138, 5049-5055 (2011).
- Froberg, J. E., Yang, L., Lee, J. T. Guided by RNAs: X-inactivation as a model for lncRNA function. J Mol Biol. 425, 3698-3706 (2013).
- Penny, G. D., Kay, G. F., Sheardown, S. A., Rastan, S., Brockdorff, N. Requirement for Xist in X chromosome inactivation. Nature. 379, 131-137 (1996).
- Marahrens, Y., Panning, B., Dausman, J., Strauss, W., Jaenisch, R. Xist-deficient mice are defective in dosage compensation but not spermatogenesis. Genes Dev. 11, 156-166 (1997).
- Clemson, C. M., McNeil, J. A., Willard, H. F., Lawrence, J. B. XIST RNA paints the inactive X chromosome at interphase: evidence for a novel RNA involved in nuclear/chromosome structure. J Cell Biol. 132, 259-275 (1996).
- Sado, T., Brockdorff, N. Advances in understanding chromosome silencing by the long non-coding RNA. Xist. Phil Trans R Soc B. 368, 20110325-20 (2013).
- Zhao, J., Sun, B. K., Erwin, J. A., Song, J. J., Lee, J. T. Polycomb proteins targeted by a short repeat RNA to the mouse X chromosome. Science. 322, 750-756 (2008).
- Plath, K., et al. Role of histone H3 lysine 27 methylation in X inactivation. Science. 300, 131-135 (2003).
- Silva, J., et al. Establishment of histone h3 methylation on the inactive X chromosome requires transient recruitment of Eed-Enx1 polycomb group complexes. Dev Cell. 4, 481-495 (2003).
- Gall, J. G. Differential synthesis of the genes for ribosomal RNA during amphibian oogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 60, 553-560 (1968).
- Femino, A. M., Fay, F. S., Fogarty, K., Singer, R. H. Visualization of single RNA transcripts in situ. Science. 280, 585-590 (1998).
- Raj, A., van den Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes. Nat Methods. 5, 877-879 (2008).
- Chaumeil, J., Augui, S., Chow, J. C., Heard, E. Combined immunofluorescence, RNA fluorescent in situ hybridization, and DNA fluorescent in situ hybridization to study chromatin changes, transcriptional activity, nuclear organization, and X-chromosome inactivation. Methods Mol Biol. 463, 297-308 (2008).
- Katayama, S., et al. Antisense transcription in the mammalian transcriptome. Science. 309, 1564-1566 (2005).
- Ogawa, Y., Xite Lee, J. T. X-inactivation intergenic transcription elements that regulate the probability of choice. Mol Cell. 11, 731-743 (2003).
- Panning, B. X inactivation in mouse ES cells: histone modifications and FISH. Methods Enzymol. 376, 419-428 (2004).
- Khalil, A. M., et al. Many human large intergenic noncoding RNAs associate with chromatin-modifying complexes and affect gene expression. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 11667-11672 (2009).
- Martin, G. R., Evans, M. J. Differentiation of clonal lines of teratocarcinoma cells: formation of embryoid bodies in vitro. Proc Natl Acad Sci U S A. 72, 1441-1445 (1975).
- Lee, J. T., Lu, N. Targeted mutagenesis of Tsix leads to nonrandom X inactivation. Cell. 99, 47-57 (1999).
- Zhang, L. F., et al. Telomeric RNAs mark sex chromosomes in stem cells. 유전학. 182, 685-698 (2009).
- Raj, A., Tyagi, S. Detection of individual endogenous RNA transcripts in situ using multiple singly labeled probes. Methods Enzymol. 472, 365-386 (2010).
- Kimura, H., Hayashi-Takanaka, Y., Goto, Y., Takizawa, N., Nozaki, N. The organization of histone H3 modifications as revealed by a panel of specific monoclonal antibodies. Cell Struct Funct. 33, 61-73 (2008).
- Ogawa, Y., Sun, B. K., Lee, J. T. Intersection of the RNA interference and X-inactivation pathways. Science. 320, 1336-1341 (2008).
- Kohlmaier, A., et al. A chromosomal memory triggered by Xist regulates histone methylation in X inactivation. PLoS Biol. 2, 171 (2004).
- Wang, K. C., Chang, H. Y. Molecular mechanisms of long noncoding RNAs. Mol Cell. 43, 904-914 (2011).
