Method Article

빠른 형광 현장에서 하이브리드 프로토콜

DOI:

10.3791/52053

⸱

November 26th, 2014

 ,  ,  ,  , 
1Division of Reproductive Sciences, Cincinnati Children's Hospital Medical Center, 2Department of Pediatrics, University of Cincinnati College of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

우리는 면역형광과 결합된 쉽게 맞춤화된 가닥 특이적 형광 FISH(in situ hybridization) 프로토콜을 개발했습니다. 이를 통해 RNA 역학을 자세히 조사하고 단일 세포 수준에서 염색질 구조, 핵 조직 및 전사 조절에 대한 통찰력을 동시에 얻을 수 있습니다.

Abstract

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면역 형광 (면역 FISH) 동일계 하이브리드 화 (FISH)에서 RNA 형광체를 결합 단백질, 후생 유전 학적 변형 및 다른 세부 사항들의 위치 파악에 동시 통찰력 RNA 현지화 공간적 동역학을 검출하는 단일 세포 수준에서 사용될 수있는 기술을 만들어 이는 면역에 의해 강조 할 수있다. X 염색체 불 활성화 긴 비 코딩 RNA (lncRNA) - 매개 유전자 침묵에 대한 패러다임이다. 포유류 암컷의 두 X-염색체 중 하나 (XIST 구름이라고도 함) X-비활성 특정 성적 증명서 (XIST) lncRNA 축적은 X 염색체 비활성화를 시작하는 중요한 단계입니다. XIST RNA를 직접 또는 간접적으로 다양한 염색질 수정 효소와 상호 작용 및 비활성 X 염색체 (사이)에 별개의 후생 유전 학적 풍경을 소개합니다. 사이의 하나 알려진 후생 유전 학적 특징은 히스톤 H3 트리메틸 라이신 27 (H3K27me3) 수정이다. 여기서 우리는 간단하고 빠른 면역 FISH를 설명XIST RNA의 현지화와 관련된 후성 유전 적 변형을 검사 H3K27me3의 면역과 함께 여러 올리고 뉴클레오티드 프로브 RNA FISH를 사용 XIST RNA를 검출하기위한 프로토콜입니다. 올리고 뉴클레오티드 프로브 짧은 배양 시간에 결과와 시험 관내 전사 RNA 프로브 (리보 프로브)에 비해 XIST RNA의 민감한 검출 기능의 사용. 이 프로토콜은 lncRNAs의 역학 및 관련 후성 ​​유전 학적 변형, 크로 마틴 구조, 핵 조직 및 전사 조절을 이해하기위한 강력한 도구를 제공합니다.

Introduction

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포유류 X 염색체 비활성화 (XCI)은 여성에서 두 개의 X-염색체 중 하나가 전사적으로 1 불 활성화 된 것을 특징으로 XX와 XY 사이의 X-연결된 유전자 복용량 불균형을 보상하기위한 전략이다. X 염색체 불 활성화 긴 비 코딩 RNA (lncRNA) 연구를위한 훌륭한 모델 시스템입니다. X 염색체 비활성화 여러 lncRNAs 의해 규제되고, 광범위 lncRNAs, 전사, 염색질 구조와 핵 조직 (2, 3) 사이의 크로스 토크 메커니즘을 밝히기 위해 지난 수십 년 동안 연구되어왔다.

X 염색체에 위치한 X 불활 센터 (XIC)의 비 RNA를 코딩하는 유전자의 제조 (4)의 개수로 이루어지는 복합 유전 궤적이다. X-비활성 특정 성적 증명서 (XIST) lncRNA eutherian 포유류는 X 염색체 불 활성화 5,6에서 중요한 역할을 하나의 lncRNA이다. XIST 성적 증명서는 쿵푸의 위치를​​ 둘러싸고진짜야 사이는 X 염색체 비활성화를 시작하고, RNA FISH를 사용하여 시각 때 구름으로 표시합니다; 이 형성 "XIST 클라우드"(7)라고합니다. XIST RNA는 다양한 염색질 수정 효소와 상호 작용하기 때문에, 침묵 크로 마틴과....

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Protocol

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1. 프로브 준비

  1. 5'- 아미노 수정하여 여러 독특한 XIST에 올리고 뉴클레오티드 (20 ~ 30 염기 길이의 올리고 뉴클레오티드, 63 ~ 65 ºC의 용융 온도, 표 1)를 얻어 물을 일시 중지합니다.
  2. 5' 아미노 수정 (총 4.5 μg의) 제조업체의 지시에 따라 아민 반응성 형광 염료와 레이블 올리고 뉴클레오티드의 풀 몰량.
    1. 클레아없는 물 5 μL의 최종 풀링 된 올리고 뉴클레오티드에 용해시키고, 올리고 뉴클레오티드 용액에 1 M 중탄산 나트륨 3 μL를 추가한다.
    2. 간단히 아민 반응성 염료와 소용돌이의 바이알에 2 μL의 DMSO를 추가합니다.
    3. DMSO의 반응성 염료와 함께 올리고 뉴클레오티드 용액을 혼합하고 어둠 속에서 실온에서 1 시간 동안 혼합물을 배양한다.
  3. 에탄올 침전 다음에 G-25의 열을 기준으로 형광 표지 된 올리고 뉴클레오티드 프로브를 정화.
    1. 750 XG 1 분 원심 분리기 G-25 컬럼은 과잉 저장 버퍼를 제거합니다.
    2. 단계 1.2.3에서 생산되는 라벨 혼합물에 40 ㎕의 클레아없는 물을 추가하고 G-25 컬럼에 적용됩니다. 2 분 동안 750 XG에 원심 분리기. <....

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Results

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빠른 면역 FISH의 대표 이미지는 그림 1A에 표시됩니다. 사이에 XIST RNA 구름과 H3K27me3 신호의 공동 현지화 여성 세포를 분화 검출되었다. 분화시, 12 일, EB 세포의 90 % 이상 XIST 클라우드 (도 1b)를 가지고 있었다. (150을 97 %, N = 그림 1C) 짧은 올리고 뉴클레오티드 프로브를 효율적으로 거의 모든 H3K27me3 신호 XIST RNA와 공동으로 현지화의 시각화로 이어지는 핵에 침투.

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그림 1 : XIST RNA와 H3K27me3는 분화에 따라 12 일에서 여성 EB 세포 분화에 H3K27me3 수정과 XIST RNA.......

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Discussion

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이 논문에서는 H3K27me3에 대한 슬라이드 준비, XIST RNA 물고기, 면역 형광을 완료하는 데보다 5 시간 소요 빠른 면역 FISH 프로토콜을 제시 하였다. 일반적으로 RNA FISH 밤새 배양을 필요로 XIST RNA 검출에 대한 일반적인 면역 FISH 방법과 비교하여,이 프로토콜은 크게 소요되는 시간을 줄일뿐만 아니라, 올리고 뉴클레오티드 프로브를 사용하여 면역 FISH의 감도를 향상뿐만 아닙니다.

XIST 고도로 X 염색체 비활성화 중에 전사되고 강렬 CIS의 사이에 축적하는 그 증명서가 발견되기 때문에, 그것은 분화 및 RNA FISH에 의한 분화 세포가 비교적 짧은 배양 시간을 활용함에 XIST RNA 신호를 검출하기 쉽다. 면역 및 RNA FISH의 최적화가 요구 될 수 있지만이 면역 FISH 프로토콜은, 관심과 풍부한 RNA의 다른 단백질에 적용 할 수 있습니다. 위해, 다른 RNA에 NUM을 프로토콜을 적용합니다가능한 올.......

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이해 상충이 선언되지 않았습니다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

RNA FISH의 올리고뉴클레오티드 설계에 도움이 되는 조언을 해주신 홍재선우 님께 감사드립니다. 또한 원고를 편집해 준 Serenity Curtis에게도 감사드립니다. 뉴욕은 일본과학진흥회(Japan Society for the Promotion of Science, JSPS)의 해외 연구를 위한 박사 후 연구원(Postdoctoral Fellowship for Research Abroad)의 지원을 받았습니다. 이 작업은 NIH (RO1-GM102184), March of Dimes Research Foundation (#6-FY12-337), Cincinnati Children's Hospital Medical Center to Y.O.의 개발 기금 및 신탁 보조금의 지원을 받았습니다.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
5'-아미노 변형이 있는 올리고뉴클레오티드IDT
Alexa Fluor 488 반응성 염료Life TechnologiesA32750
MicroSpin G-25 컬럼GE Healthcare27-5325-01
Cytospin 2Shandon59900102
소 혈청 알부민, 분자 생물학 등급(혼성화 완충액용)Roche
히스톤 H3K27me3 항체활성 모티프61017
Alexa Fluor 555 염소 안티 마우스, 고도로 교차 흡착된Life TechnologiesA21424
ProLong Gold 퇴색 방지 시약Life TechnologiesP36931
10715859103

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Payer, B., Lee, J. T. X chromosome dosage compensation: how mammals keep the balance. Annu Rev Genet. 42, 733-772 (2008).
  2. Lee, J. T. Gracefully ageing at 50, X-chromosome inactivation becomes a paradigm for RNA and chromatin control.

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Xist RNAImmunofluorescenceFluorescent In Situ HybridizationHistone H3K27me3X chromosome InactivationOligonucleotide ProbesEmbryoid Body CellsCytospin PreparationFluorescence MicroscopyEpigenetic Modification

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