クイック蛍光<em>その場で</emX染色体不活性化におけるヒストン修飾の免疫蛍光とのXist RNA複合のための>ハイブリダイゼーションプロトコル
Summary
We developed an easily customized strand-specific fluorescent in situ hybridization (FISH) protocol combined with immunofluorescence. This allows for a detailed examination of RNA dynamics with simultaneous insight into the chromatin structure, nuclear organization, and transcriptional regulation at the single cell level.
Abstract
免疫蛍光（免疫FISH）、 インサイチュハイブリダイゼーション （FISH） で RNA蛍光を組み合わせることにより、タンパク質の局在に同時洞察、エピジェネティックな改変およびその他の詳細とRNAの局在化の空間的なダイナミックスを検出するために、単一細胞レベルで使用することができる技術を作成その免疫蛍光によって強調することができる。 X染色体不活性化は、長い非コードRNA（lncRNA）媒介遺伝子サイレンシングのためのパラダイムである。哺乳類の雌の二つのX染色体の1のX非アクティブな特定の転写産物（Xistの雲と呼ばれる）（のXist）lncRNAの蓄積は、X染色体不活性化を開始する重要なステップです。のXist RNAは、直接または間接的に、様々なクロマチン修飾酵素と相互作用し、不活性X染色体（XI）に明確なエピジェネティックな風景を紹介します。 xiの一つの既知のエピジェネティックな特徴は、ヒストンH3のトリメチルリジン27（H3K27me3）変形例である。ここでは、簡単かつ迅速免疫FISHを記述のXist RNAおよび関連するエピジェネティック修飾の局在を調べるためにH3K27me3の免疫蛍光に結合された複数のオリゴヌクレオチドプローブとのRNA FISHを使用してのXist RNAを検出するためのプロトコル。 インビトロ転写されたRNAプローブ（リボプローブ）と比較して、より短いインキュベーション時間とのXist RNAのより高感度な検出オリゴヌクレオチドプローブの結果を使用して。このプロトコルは、lncRNAsのダイナミクスとそれに関連するエピジェネティックな修飾、クロマチン構造、原子力組織と転写調節を理解するための強力なツールを提供します。
Introduction
哺乳類のX染色体不活性化（XCI）は、雌では二つのX染色体の1が1転写不活性化され、XXとXY間のX連鎖遺伝子量のアンバランスを補償するための戦略である。 X染色体不活性化は、長い非コードRNA（lncRNA）研究のための優れたモデルシステムです。 X染色体不活性化は、複数のlncRNAsによって調節され、広範にlncRNAs、転写、クロマチン構造および核組織2,3間のクロストークメカニズムを解明するために、過去数十年にわたって研究されてきた。
X染色体上に位置するX不活性化センター（XIC）は、非コードRNA 4を産生する遺伝子の数で構成される複雑な遺伝子座である。 X-非アクティブな特定の転写産物（のXist）lncRNA真獣類哺乳動物においては、X染色体不活性化5,6に重要な役割を果たしているそのようなlncRNAです。 Xistの転写物のfuの位置を囲むトゥーレXiはX染色体不活性化を開始し、RNA FISHを用いて可視化するとき雲のように表示される。この形成は、「Xistのクラウド」7と呼ばれている。のXist RNAは、様々なクロマチン修飾酵素と相互作用するので、サイレントクロマチンと抑圧的な転写のための別のエピジェネティック修飾とXistの雲の共局在は、X染色体不活性化8の間に観察されている。例えば、XistのRNAはH3K27me3を担当し、抑圧的なクロマチン状態9を誘導するポリコーム抑制複合体2（PRC2）と対話します。 Xiと集中的なH3K27me3の修正との共局在上のXistの雲の発生は、西10,11の通性ヘテロクロマチン風景を表している。
そのようなDNA / RNA FISHなどの細胞遺伝学的技術は、強化された感度で最近、高度な技術を放射性標識したプローブ12を用いた従来の方法から長い道のりを歩んでいると複数のオリゴヌクレオチドプローブ13,14を用いた蛍光イメージング。免疫蛍光と連結DNA / RNAのFISHは、日常的に、時空間核組織、RNAの局在化、クロマチン構造および修正を理解するために、細胞学的ツールとして使用されてきた。 RNA FISHのための最も標準的なプローブの調製は、プラスミドまたは細菌人工染色体（BAC）クローンおよびニックトランスレーションまたはランダムプライミング15のいずれかそれらのその後の標識の使用を含む。しかし、ヒトにおけるマウスの遺伝子の約70％の遺伝子の40％は、したがって、センスおよびアンチセンス転写物を区別するために、鎖特異的FISH法を必要とする、センスおよびアンチセンス転写物16の重なりを示している。 インビトロ転写されたRNAプローブ（リボプローブ）は、多くの場合、鎖特異的RNA FISH 17,18のために使用される。しかしながら、これは、T7、SP6又はT3プロモータープラスミドクローンまたはPCR産物を調製し、リボプローブを合成することを含む。さらに、リボプローブはGENOMから派生icをDNAまたはcDNAは、多くの場合、高いバックグラウンドノイズを生じる非特異的領域および反復エレメントを含む。別の問題は、長さが数百ヌクレオチドであり、複数のフルオロフォアを含むリボプローブは、効率的に核内に浸透することができないということである。これを回避するために、終了時の単一のフルオロフォアで標識された複数の短いオリゴヌクレオチドプローブは、良好な感度、均一な信号強度、精製および取り扱い14の容易さを有するように開発されてきた。また、DNAオリゴヌクレオチドは、一般的にRNAよりも安定である。我々は、X染色体不活性化の過程のXist lncRNAによって誘発される西のエピジェネティックなダイナミクスを理解するために、免疫蛍光でのXist RNA FISH 19のオリゴヌクレオチドを用いて、同様の戦略を適用した。このプロトコルは、オリゴヌクレオチドプローブおよび適切な細胞の調製、ならびに免疫蛍光およびRNA FISHの利用の作成を記載している。複数oligonucleを使用してのXist RNA FISHotidesのXist RNA FISHは自分の研究室で日常的に行われた場合、長期的に費用対効果の高いアプローチです。この技術は、同時にエピジェネティック修飾または因子との共局在をマッピングしながら、細胞内でlncRNAsを同定するために用いることができる。プロトコルの1つの主な利点は、簡単に自分の研究関心に合わせてそれを変更する機能です。
Protocol
Representative Results
Discussion
本稿では、H3K27me3ためのスライドの準備、XistのRNA FISH、および免疫蛍光を完了するために、5未満の時間がかかる迅速な免疫FISHプロトコルを提示している。通常RNA FISHのための一晩のインキュベーションを必要とするXist RNA検出のための一般的な免疫FISH法と比較して、このプロトコルは、有意に費やされる時間を減少させるだけでなく、オリゴヌクレオチドプローブを使用して免疫FISHの感度を…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Hongjae Sunwoo for helpful advice for oligonucleotide design in RNA FISH. We also thank Serenity Curtis for editing the manuscript. N.Y. was supported by a Postdoctoral Fellowship for Research Abroad of the Japan Society for the Promotion of Science (JSPS). This work was supported by the NIH (RO1-GM102184), the March of Dimes Research Foundation (#6-FY12-337), and the Developmental Fund and Trustee Grant at Cincinnati Children’s Hospital Medical Center to Y.O.
Materials
| oligonucleotides with 5’-amine modification | IDT | |
| Alexa Fluor 488 Reactive Dye | Life Technologies | A32750 |
| MicroSpin G-25 columns | GE Healthcare | 27-5325-01 |
| Cytospin 2 | Shandon | 59900102 |
| Bovine Serum Albumin, Molecular Biology Grade (for hybridization buffer) | Roche | 10715859103 |
| Histone H3K27me3 antibody | Active Motif | 61017 |
| Accutase | Innovative Cell Technologies | AT104 |
| Alexa Fluor 555 Goat Anti-Mouse, highly cross-adsorbed | Life Technologies | A21424 |
| ProLong Gold antifade reagent | Life Technologies | P36931 |
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