빠른 형광<em> 현장에서</emX 염색체 불 활성화에 히스톤 수정의 면역 형광와 XIST RNA 결합에 대한> 하이브리드 프로토콜
Summary
We developed an easily customized strand-specific fluorescent in situ hybridization (FISH) protocol combined with immunofluorescence. This allows for a detailed examination of RNA dynamics with simultaneous insight into the chromatin structure, nuclear organization, and transcriptional regulation at the single cell level.
Abstract
면역 형광 (면역 FISH) 동일계 하이브리드 화 (FISH)에서 RNA 형광체를 결합 단백질, 후생 유전 학적 변형 및 다른 세부 사항들의 위치 파악에 동시 통찰력 RNA 현지화 공간적 동역학을 검출하는 단일 세포 수준에서 사용될 수있는 기술을 만들어 이는 면역에 의해 강조 할 수있다. X 염색체 불 활성화 긴 비 코딩 RNA (lncRNA) – 매개 유전자 침묵에 대한 패러다임이다. 포유류 암컷의 두 X-염색체 중 하나 (XIST 구름이라고도 함) X-비활성 특정 성적 증명서 (XIST) lncRNA 축적은 X 염색체 비활성화를 시작하는 중요한 단계입니다. XIST RNA를 직접 또는 간접적으로 다양한 염색질 수정 효소와 상호 작용 및 비활성 X 염색체 (사이)에 별개의 후생 유전 학적 풍경을 소개합니다. 사이의 하나 알려진 후생 유전 학적 특징은 히스톤 H3 트리메틸 라이신 27 (H3K27me3) 수정이다. 여기서 우리는 간단하고 빠른 면역 FISH를 설명XIST RNA의 현지화와 관련된 후성 유전 적 변형을 검사 H3K27me3의 면역과 함께 여러 올리고 뉴클레오티드 프로브 RNA FISH를 사용 XIST RNA를 검출하기위한 프로토콜입니다. 올리고 뉴클레오티드 프로브 짧은 배양 시간에 결과와 시험 관내 전사 RNA 프로브 (리보 프로브)에 비해 XIST RNA의 민감한 검출 기능의 사용. 이 프로토콜은 lncRNAs의 역학 및 관련 후성 유전 학적 변형, 크로 마틴 구조, 핵 조직 및 전사 조절을 이해하기위한 강력한 도구를 제공합니다.
Introduction
포유류 X 염색체 비활성화 (XCI)은 여성에서 두 개의 X-염색체 중 하나가 전사적으로 1 불 활성화 된 것을 특징으로 XX와 XY 사이의 X-연결된 유전자 복용량 불균형을 보상하기위한 전략이다. X 염색체 불 활성화 긴 비 코딩 RNA (lncRNA) 연구를위한 훌륭한 모델 시스템입니다. X 염색체 비활성화 여러 lncRNAs 의해 규제되고, 광범위 lncRNAs, 전사, 염색질 구조와 핵 조직 (2, 3) 사이의 크로스 토크 메커니즘을 밝히기 위해 지난 수십 년 동안 연구되어왔다.
X 염색체에 위치한 X 불활 센터 (XIC)의 비 RNA를 코딩하는 유전자의 제조 (4)의 개수로 이루어지는 복합 유전 궤적이다. X-비활성 특정 성적 증명서 (XIST) lncRNA eutherian 포유류는 X 염색체 불 활성화 5,6에서 중요한 역할을 하나의 lncRNA이다. XIST 성적 증명서는 쿵푸의 위치를 둘러싸고진짜야 사이는 X 염색체 비활성화를 시작하고, RNA FISH를 사용하여 시각 때 구름으로 표시합니다; 이 형성 "XIST 클라우드"(7)라고합니다. XIST RNA는 다양한 염색질 수정 효소와 상호 작용하기 때문에, 침묵 크로 마틴과 억압 전사에 대해 서로 다른 후성 유전 학적 수정을 XIST 구름의 공동 현지화는 X 염색체 불 활성화 (8) 동안 관찰된다. 예를 들어, XIST RNA는 H3K27me3에 대한 책임과 억압 염색질 상태 (9)을 유도 polycomb 억압 복잡한 2 (PRC2)와 상호 작용합니다. 사이와 집중 H3K27me3 수정과의 공동 현지화에 XIST 구름의 발생 사이 (10, 11)의 통성 이질 염색질 풍경을 나타냅니다.
이러한 DNA / RNA FISH 등의 세포 유전 학적 기술은 향상된 감도와 최근의 진보 된 기술에 방사성 동위 원소를 프로브 (12)를 사용하여 전통적인 방법에서 먼 길을왔다여러 올리고 뉴클레오티드 프로브 (13, 14)를 사용하여 형광 이미징. 면역 형광과 함께 DNA / RNA의 물고기는 정기적으로 시공간 핵 조직, RNA 현지화, 크로 마틴 구조 및 수정을 이해하는 세포 학적 도구로 사용되어왔다. RNA FISH에 대한 대부분의 표준 프로브 준비 플라스미드 또는 박테리아 인공 염색체 (BAC) 클론 닉 번역 또는 임의 프라이밍 (15) 중 하나를 자신의 다음 라벨의 사용을 포함한다. 그러나 생쥐의 유전자의 약 70 %와 인간 유전자의 40 %는 센스 및 안티센스 성적 증명서를 구별하기 위해, 따라서 가닥 특정 FISH 방법을 필요로 센스 및 안티센스 성적 증명서 (16)의 중첩을 보여줍니다. 시험 관내 전사 RNA 프로브를 (리보 프로브 (riboprobe)를 )는 종종 특정 가닥 RNA의 FISH (17, 18)에 사용된다; 그러나, 이는 T7, SP6, 또는 T3 프로모터와 리보 프로브 합성 플라스미드 클론 또는 PCR 산물을 준비하는 것을 포함한다. 또한, genom에서 파생 된 리보 프로브IC DNA 또는 cDNA를 종종 높은 배경 노이즈가 아닌 특정 지역과 반복적 인 요소가 포함되어 있습니다. 또 다른 문제는, 길이 수백 뉴클레오타이드 복수 형광체를 포함하는 리보 프로브를 효율적으로 핵으로 침투 할 수 없다는 것이다. 이를 회피하기 위해, 하나의 단부에서 복수의 형광 물질로 표지 된 올리고 뉴클레오티드 프로브 짧아 양호한 감도, 신호 강도가 균일하고, 정제의 용이성 및 14 취급이 개발되었다. 또한, DNA 올리고 뉴클레오티드는 일반적으로 RNA보다 더 안정하다. 우리는 X 염색체 불 활성화 과정 XIST lncRNA 의해 유도 후생 유전 학적 사이의 역학 관계를 이해하기 위해 면역 형광 XIST RNA FISH와 19의 올리고 뉴클레오티드를 사용하여 유사한 전략을 적용 하였다. 이 프로토콜은 올리고 뉴클레오티드 프로브 및 세포의 적절한 제제의 창조뿐만 아니라 면역 형광 및 RNA FISH의 이용을 설명한다. 여러 oligonucle를 사용 XIST RNA FISHXIST RNA 물고기가 하나의 실험실에서 일상적으로 수행되는 경우 otides은 장기적으로 비용 효과적인 방법입니다. 이 기술은 후생 유전 학적 변형을 동시에 또는 인자와의 공동 현지화를 맵핑하는 동안 세포에서 lncRNAs를 식별하는데 사용될 수있다. 프로토콜의 하나의 큰 장점은 쉽게 하나의 연구 분야에 맞도록 수정할 수있는 기능입니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 논문에서는 H3K27me3에 대한 슬라이드 준비, XIST RNA 물고기, 면역 형광을 완료하는 데보다 5 시간 소요 빠른 면역 FISH 프로토콜을 제시 하였다. 일반적으로 RNA FISH 밤새 배양을 필요로 XIST RNA 검출에 대한 일반적인 면역 FISH 방법과 비교하여,이 프로토콜은 크게 소요되는 시간을 줄일뿐만 아니라, 올리고 뉴클레오티드 프로브를 사용하여 면역 FISH의 감도를 향상뿐만 아닙니다.
…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Hongjae Sunwoo for helpful advice for oligonucleotide design in RNA FISH. We also thank Serenity Curtis for editing the manuscript. N.Y. was supported by a Postdoctoral Fellowship for Research Abroad of the Japan Society for the Promotion of Science (JSPS). This work was supported by the NIH (RO1-GM102184), the March of Dimes Research Foundation (#6-FY12-337), and the Developmental Fund and Trustee Grant at Cincinnati Children’s Hospital Medical Center to Y.O.
Materials
| oligonucleotides with 5’-amine modification | IDT | |
| Alexa Fluor 488 Reactive Dye | Life Technologies | A32750 |
| MicroSpin G-25 columns | GE Healthcare | 27-5325-01 |
| Cytospin 2 | Shandon | 59900102 |
| Bovine Serum Albumin, Molecular Biology Grade (for hybridization buffer) | Roche | 10715859103 |
| Histone H3K27me3 antibody | Active Motif | 61017 |
| Accutase | Innovative Cell Technologies | AT104 |
| Alexa Fluor 555 Goat Anti-Mouse, highly cross-adsorbed | Life Technologies | A21424 |
| ProLong Gold antifade reagent | Life Technologies | P36931 |
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