Hurtig Fluorescent<em> In Situ</em> Hybridisering Protokoll for Xist RNA Kombinert med Immunfluorescens av Histone Modification i X-kromosom inaktivering
Summary
We developed an easily customized strand-specific fluorescent in situ hybridization (FISH) protocol combined with immunofluorescence. This allows for a detailed examination of RNA dynamics with simultaneous insight into the chromatin structure, nuclear organization, and transcriptional regulation at the single cell level.
Abstract
Kombinere RNA fluorescerende in situ hybridisering (FISH) med immunfluorescens (immun-FISH) skaper en teknikk som kan brukes på celle nivå for å oppdage de romlige dynamikken i RNA lokalisering med samtidig innsikt i lokalisering av proteiner, epigenetiske modifikasjoner og andre detaljer som kan bli markert ved immunfluorescens. X-kromosom inaktivering er et paradigme for lang ikke-kodende RNA (lncRNA) -mediert genet Slå. X-inaktive spesifikk transkripsjon (Xist) lncRNA akkumulering (kalt en Xist sky) på en av de to X-kromosomer i pattedyr kvinner er et kritisk punkt for å starte X-kromosom inaktivering. Xist RNA direkte eller indirekte samhandler med ulike kromatin modifiserende enzymer og introduserer forskjellige epigenetiske landskap til den inaktive X-kromosom (Xi). En kjent epigenetisk kjennetegn på Xi er Histone H3 trimetyl-lysin 27 (H3K27me3) modifikasjon. Her beskriver vi en enkel og rask immun-FISHprotokoll for påvisning Xist RNA bruker RNA FISH med flere oligonukleotidprober kombinert med immunfluorescens av H3K27me3 å undersøke lokalisering av Xist RNA og tilhørende epigenetiske modifikasjoner. Ved å bruke oligonukleotidprober resulterer i en kortere inkuberingstid og mer følsom påvisning av Xist RNA sammenlignet med in vitro-transkriberte RNA-prober (riboprober). Denne protokollen gir et kraftig verktøy for å forstå dynamikken i lncRNAs og dens tilhørende epigenetisk modifikasjon, kromatinstruktur, kjernekraft organisasjon og transkripsjonsregulering.
Introduction
Pattedyr-X-kromosom inaktive (XCI) er en strategi for å kompensere for ubalansen i X-bundet gen dosering mellom XX og XY, karakterisert ved at en av de to X-kromosomet hos kvinner er transkripsjonelt inaktivert 1. X-kromosom inaktivering er en stor modellsystem for lang ikke-kodende RNA (lncRNA) forskning. X-kromosom inaktivering er regulert av flere lncRNAs, og har blitt grundig studert i løpet av de siste tiårene for å avdekke crosstalk mekanismer mellom lncRNAs, transkripsjon, kromatinstruktur og kjernefysiske organisasjon 2, 3.
X inaktivesenter (XIC) lokalisert på X-kromosomet er en kompleks genetisk lokus som består av et antall gener som produserer ikke-kodende RNA 4. X-inaktive spesifikk transkripsjon (Xist) lncRNA i eutherian pattedyr er en slik lncRNA som spiller en avgjørende rolle i X-kromosom inaktive 5,6. Xist transkripsjoner surround plasseringen av future Xi å starte X-kromosom inaktivering, og vises som en sky når visualisert ved hjelp av RNA FISH; denne formasjonen blir referert til som "Xist Cloud" 7. Siden Xist RNA samhandler med ulike kromatin modifiserende enzymer, er samlokalisering av de Xist skyer med ulike epigenetiske modifikasjoner for stille kromatin og undertrykkende transkripsjon observert under X-kromosom inaktive 8. For eksempel samhandler med polycomb undertrykkende kompleks 2 (PRC2) som er ansvarlig for H3K27me3 og induserer en undertrykkende kromatin tilstand 9 Xist RNA. Forekomsten av Xist skyen på Xi og dens samlokalisering med den intensive H3K27me3 modifikasjon representerer en fakultativ heterochromatin landskapet i Xi 10,11.
Cytogenetiske teknikker, for eksempel DNA / RNA FISH har kommet en lang vei fra den tradisjonelle metoden ved hjelp av radiomerkede sonder 12 til siste og avanserte teknikker med forbedret sensitivitet ogfluorescerende bildebehandling bruker flere oligonukleotidprober 13,14. DNA / RNA FISH kombinert med immunfluorescens har blitt rutinemessig brukt som en cytologisk verktøy for å forstå spatiotemporal atom organisasjon, RNA lokalisering, kromatinstruktur og modifikasjoner. Den mest vanlige probe RNA klargjøring for FISH innebærer bruk av plasmid eller bakterielle kunstig kromosom (BAC) kloner og deres påfølgende merking enten ved nick-translasjon eller tilfeldig priming 15. Imidlertid nesten 70% av gener hos mus og 40% av gener hos mennesker viser en overlapping på sense og antisense-transkripter 16, og dermed kreve en tråd-spesifikke FISH metode for å skille sense og antisense-transkripter. In vitro-transkriberte RNA-prober (riboprobe ) blir ofte brukt for tråd-spesifikke RNA FISH 17,18; Men dette innebærer fremstilling av en plasmid klon eller PCR-produkt med T7, SP6, eller T3-promoteren og syntetisere riboprober. Videre riboprober avledet fra genomic DNA eller cDNA inneholder ofte ikke-spesifikke regioner og repetitive elementer, noe som resulterer i høy bakgrunnsstøy. En annen sak er at riboprober, som er et par hundre nukleotider i lengde og inneholder flere fluoroforene, kan ikke effektivt trenge inn i kjernen. For å omgå dette, har flere kortere oligonukleotid-prober merket med en enkelt fluorofor ved enden blitt utviklet som har god følsomhet, styrke ensartet signal, og å lette rensing og håndtering 14. I tillegg er DNA-oligonukleotider er generelt mer stabile enn RNA. Vi har anvendt en lignende strategi med å bruke oligonukleotider i Xist RNA FISH 19 med immunfluorescens å forstå den epigenetiske dynamikken i Xi indusert av Xist lncRNA under prosessen med X-kromosom inaktivering. Denne protokollen beskriver dannelsen av oligonukleotidprober og riktig tilberedning av celler, så vel som anvendelse av immunfluorescens og RNA fisk. Xist RNA FISH bruker flere oligonucleotides er kostnadseffektiv tilnærming på lang sikt hvis Xist RNA FISH utføres rutinemessig i ett laboratorium. Denne teknikken kan brukes til å identifisere lncRNAs i cellene og samtidig kartlegging dens ko-lokalisering med epigenetiske modifikasjoner eller faktorer. En stor fordel med protokollen er muligheten til enkelt å endre det som passer ens forskningsinteresser.
Protocol
Representative Results
Discussion
I denne artikkelen har vi presentert en rask immun-FISH protokoll som tar mindre enn fem timer å fullføre lysbilde forberedelse, Xist RNA FISH, og immunfluorescens for H3K27me3. Sammenlignet med den generelle immun-FISH tilnærming for Xist RNA deteksjon, som vanligvis trenger overnatting inkubasjon for RNA FISH, denne protokollen ikke bare reduserer tid brukt, men også forbedrer følsomheten immun-FISH hjelp oligonukleotidprober.
Siden Xist er sterkt transkribert under X-kromosom inaktiv…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Hongjae Sunwoo for helpful advice for oligonucleotide design in RNA FISH. We also thank Serenity Curtis for editing the manuscript. N.Y. was supported by a Postdoctoral Fellowship for Research Abroad of the Japan Society for the Promotion of Science (JSPS). This work was supported by the NIH (RO1-GM102184), the March of Dimes Research Foundation (#6-FY12-337), and the Developmental Fund and Trustee Grant at Cincinnati Children’s Hospital Medical Center to Y.O.
Materials
| oligonucleotides with 5’-amine modification | IDT | |
| Alexa Fluor 488 Reactive Dye | Life Technologies | A32750 |
| MicroSpin G-25 columns | GE Healthcare | 27-5325-01 |
| Cytospin 2 | Shandon | 59900102 |
| Bovine Serum Albumin, Molecular Biology Grade (for hybridization buffer) | Roche | 10715859103 |
| Histone H3K27me3 antibody | Active Motif | 61017 |
| Accutase | Innovative Cell Technologies | AT104 |
| Alexa Fluor 555 Goat Anti-Mouse, highly cross-adsorbed | Life Technologies | A21424 |
| ProLong Gold antifade reagent | Life Technologies | P36931 |
References
- Payer, B., Lee, J. T. X chromosome dosage compensation: how mammals keep the balance. Annu Rev Genet. 42, 733-772 (2008).
- Lee, J. T. Gracefully ageing at 50, X-chromosome inactivation becomes a paradigm for RNA and chromatin control. Nat Rev Mol Cell Biol. 12, 815-826 (2011).
- Gendrel, A. V., Heard, E. Fifty years of X-inactivation research. Development. 138, 5049-5055 (2011).
- Froberg, J. E., Yang, L., Lee, J. T. Guided by RNAs: X-inactivation as a model for lncRNA function. J Mol Biol. 425, 3698-3706 (2013).
- Penny, G. D., Kay, G. F., Sheardown, S. A., Rastan, S., Brockdorff, N. Requirement for Xist in X chromosome inactivation. Nature. 379, 131-137 (1996).
- Marahrens, Y., Panning, B., Dausman, J., Strauss, W., Jaenisch, R. Xist-deficient mice are defective in dosage compensation but not spermatogenesis. Genes Dev. 11, 156-166 (1997).
- Clemson, C. M., McNeil, J. A., Willard, H. F., Lawrence, J. B. XIST RNA paints the inactive X chromosome at interphase: evidence for a novel RNA involved in nuclear/chromosome structure. J Cell Biol. 132, 259-275 (1996).
- Sado, T., Brockdorff, N. Advances in understanding chromosome silencing by the long non-coding RNA. Xist. Phil Trans R Soc B. 368, 20110325-20 (2013).
- Zhao, J., Sun, B. K., Erwin, J. A., Song, J. J., Lee, J. T. Polycomb proteins targeted by a short repeat RNA to the mouse X chromosome. Science. 322, 750-756 (2008).
- Plath, K., et al. Role of histone H3 lysine 27 methylation in X inactivation. Science. 300, 131-135 (2003).
- Silva, J., et al. Establishment of histone h3 methylation on the inactive X chromosome requires transient recruitment of Eed-Enx1 polycomb group complexes. Dev Cell. 4, 481-495 (2003).
- Gall, J. G. Differential synthesis of the genes for ribosomal RNA during amphibian oogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 60, 553-560 (1968).
- Femino, A. M., Fay, F. S., Fogarty, K., Singer, R. H. Visualization of single RNA transcripts in situ. Science. 280, 585-590 (1998).
- Raj, A., van den Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes. Nat Methods. 5, 877-879 (2008).
- Chaumeil, J., Augui, S., Chow, J. C., Heard, E. Combined immunofluorescence, RNA fluorescent in situ hybridization, and DNA fluorescent in situ hybridization to study chromatin changes, transcriptional activity, nuclear organization, and X-chromosome inactivation. Methods Mol Biol. 463, 297-308 (2008).
- Katayama, S., et al. Antisense transcription in the mammalian transcriptome. Science. 309, 1564-1566 (2005).
- Ogawa, Y., Xite Lee, J. T. X-inactivation intergenic transcription elements that regulate the probability of choice. Mol Cell. 11, 731-743 (2003).
- Panning, B. X inactivation in mouse ES cells: histone modifications and FISH. Methods Enzymol. 376, 419-428 (2004).
- Khalil, A. M., et al. Many human large intergenic noncoding RNAs associate with chromatin-modifying complexes and affect gene expression. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 11667-11672 (2009).
- Martin, G. R., Evans, M. J. Differentiation of clonal lines of teratocarcinoma cells: formation of embryoid bodies in vitro. Proc Natl Acad Sci U S A. 72, 1441-1445 (1975).
- Lee, J. T., Lu, N. Targeted mutagenesis of Tsix leads to nonrandom X inactivation. Cell. 99, 47-57 (1999).
- Zhang, L. F., et al. Telomeric RNAs mark sex chromosomes in stem cells. 유전학. 182, 685-698 (2009).
- Raj, A., Tyagi, S. Detection of individual endogenous RNA transcripts in situ using multiple singly labeled probes. Methods Enzymol. 472, 365-386 (2010).
- Kimura, H., Hayashi-Takanaka, Y., Goto, Y., Takizawa, N., Nozaki, N. The organization of histone H3 modifications as revealed by a panel of specific monoclonal antibodies. Cell Struct Funct. 33, 61-73 (2008).
- Ogawa, Y., Sun, B. K., Lee, J. T. Intersection of the RNA interference and X-inactivation pathways. Science. 320, 1336-1341 (2008).
- Kohlmaier, A., et al. A chromosomal memory triggered by Xist regulates histone methylation in X inactivation. PLoS Biol. 2, 171 (2004).
- Wang, K. C., Chang, H. Y. Molecular mechanisms of long noncoding RNAs. Mol Cell. 43, 904-914 (2011).
