Быстрый Люминесцентная<em> На месте</em> Гибридизация Протокола о Xist РНК в сочетании с Иммунофлуоресценции модификации гистонов в X-хромосоме инактивации
Summary
We developed an easily customized strand-specific fluorescent in situ hybridization (FISH) protocol combined with immunofluorescence. This allows for a detailed examination of RNA dynamics with simultaneous insight into the chromatin structure, nuclear organization, and transcriptional regulation at the single cell level.
Abstract
Сочетание РНК люминесцентные в гибридизация (FISH) с иммунофлюоресценции (иммуно-FISH) создает технику, которая может быть использована в одном уровне клетки для выявления пространственной динамики РНК локализации с одновременным проникновением в локализации белков, эпигенетических модификаций и других деталей которые могут быть выделены с помощью иммунофлуоресценции. Инактивация Х-хромосомы является парадигмой для длительного некодирующая РНК (lncRNA) опосредованной сайленсинга. X-неактивной конкретных стенограмма (Xist) накопление lncRNA (так называемый Xist облако) на одном из двух Х-хромосом у самок млекопитающих является важным шагом для начала инактивации Х-хромосомы. Xist РНК, прямо или косвенно взаимодействует с различными хроматина модифицирующие ферменты и вводит различные эпигенетические ландшафты в неактивной Х-хромосомы (XI). Один известный эпигенетические отличительной чертой Xi является гистонов H3 триметил-лизин 27 (H3K27me3) модификация. Здесь мы опишем простой и быстрый иммуно-FISHпротокол для обнаружения Xist РНК с использованием РНК FISH с несколькими датчиками олигонуклеотидных в сочетании с иммунофлюоресценции H3K27me3 изучить локализацию Xist РНК и связанные изменения эпигенетических. С использованием олигонуклеотидных зондов результатов в более короткие сроки инкубации и более чувствительного обнаружения Xist РНК по сравнению с в пробирке транскрибируемых РНК-зондов (рибозонды). Этот протокол обеспечивает мощный инструмент для понимания динамики lncRNAs и связанных с ним эпигенетические модификации, структура хроматина, ядерной организации и регуляции транскрипции.
Introduction
Млекопитающих Х-хромосомы инактивации (XCI) представляет собой стратегию для компенсации дисбаланса в Х-хромосомой гена дозе между XX и XY, в котором один из двух Х-хромосом у женщин является транскрипционно инактивированные 1. Инактивация Х-хромосомы является большая модель системы долго некодирующих РНК (lncRNA) исследований. Инактивация Х-хромосомы регулируется несколькими lncRNAs, и была тщательно изучена в течение последних нескольких десятилетий, чтобы раскрыть механизмы перекрестных помех между lncRNAs, транскрипция, структуры хроматина и ядерной организации 2, 3.
Х инактивации центр (XIC) расположен на Х-хромосоме представляет собой комплекс генетический локус состоит из ряда генов, продуцирующих некодирующих РНК 4. X-неактивной конкретных стенограмма (Xist) lncRNA в плацентарные млекопитающие, является одним из таких lncRNA который играет важнейшую роль в X-хромосоме инактивации 5,6. XIST транскрипты окружают расположение фура Xi инициировать инактивации Х-хромосомы, и появляются в виде облака, когда визуализированы с помощью РНК рыбы; Это образование называется как "облако" Xist 7. С Xist РНК взаимодействует с различными хроматина изменения ферменты, со-локализация облака Xist с различными эпигенетических модификаций для молчащего хроматина и репрессивного транскрипции наблюдается при X-хромосомы инактивации 8. Например, Xist РНК взаимодействует с Поликомб репрессивного комплекса 2 (PRC2), который отвечает за H3K27me3 и вызывает репрессивный хроматина 9. Появление Xist облако на Си и его совместной локализации с интенсивным модификации H3K27me3 представляет собой добровольную гетерохроматина ландшафт Xi 10,11.
Цитогенетические методы, такие как ДНК / РНК FISH прошли долгий путь от традиционного метода используются меченые зонды 12 на последние и передовые технологии с повышенной чувствительностью ифлуоресцентных изображений с использованием нескольких олигонуклеотидных зондов 13,14. ДНК / РНК FISH в сочетании с иммунофлюоресценции регулярно используется в качестве цитологического инструментом для понимания пространственно-временной ядерной организации, локализация РНК, структура хроматина и модификации. Наиболее стандартный препарат зонд для РНК FISH включает использование плазмиды или бактериальных искусственных хромосом (ВАС) клонов и их последующей классификации либо с переводом ник или случайного праймера 15. Тем не менее, почти 70% генов у мышей и 40% генов у человека показывают, перекрытие смысловых и антисмысловых транскриптов 16, следовательно, требует метод FISH нити конкретным районам в целях отличить смысл и антисмысловых транскриптов. В пробирке, транскрибируемые РНК-зондов (Riboprobe ) часто используются для цепи РНК с FISH 17,18; Однако, это включает подготовку плазмиды клона или ПЦР-продукта с Т7, SP6 или T3 промотора и синтеза рибонуклеотидными зондами. Кроме того, рибозонды получены из геномаIC ДНК или кДНК часто содержат не конкретные регионы и повторяющиеся элементы, что приводит к высокой фонового шума. Другой вопрос, что рибозонды, которые несколько сотен нуклеотидов в длину и содержат несколько флуорофоры, не может эффективно проникать в ядро. Чтобы обойти это, несколько короче олигонуклеотидных зондов, меченных с помощью одного флуорофора в конце были разработаны, которые имеют хорошую чувствительность, равномерную силу сигнала и простоту очистки и обработки 14. Кроме того, олигонуклеотиды, ДНК, как правило, более стабильны, чем РНК. Мы применили подобную стратегию с использованием олигонуклеотидов в Xist РНК FISH 19 с иммунофлуоресценции понимать эпигенетические динамику Xi, вызванные Xist lncRNA в процессе инактивации Х-хромосомы. Этот протокол описывает создание олигонуклеотидных зондов и надлежащей подготовки клеток, а также использование иммунофлуоресценции и РНК рыбы. Xist РНК FISH с использованием нескольких oligonucleotides является экономически эффективным подходом в долгосрочной перспективе, если Xist РНК FISH проводится на регулярной основе в своей лаборатории. Этот метод может быть использован для идентификации lncRNAs в клетках, одновременно отображение его совместную локализацию с эпигенетических модификаций или факторов. Одно из главных преимуществ протокола является возможность легко изменять его в соответствии с своих научных интересов.
Protocol
Representative Results
Discussion
В этой статье мы представили краткий протокол иммуно-FISH, что занимает меньше 5 ч завершить подготовку слайдов, Xist РНК рыбу, и иммунофлюоресценции H3K27me3. По сравнению с общим подходом иммуно-FISH для Xist РНК обнаружение, которые, как правило, нуждается в инкубации в течение ночи для РНК FISH, это…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Hongjae Sunwoo for helpful advice for oligonucleotide design in RNA FISH. We also thank Serenity Curtis for editing the manuscript. N.Y. was supported by a Postdoctoral Fellowship for Research Abroad of the Japan Society for the Promotion of Science (JSPS). This work was supported by the NIH (RO1-GM102184), the March of Dimes Research Foundation (#6-FY12-337), and the Developmental Fund and Trustee Grant at Cincinnati Children’s Hospital Medical Center to Y.O.
Materials
| oligonucleotides with 5’-amine modification | IDT | |
| Alexa Fluor 488 Reactive Dye | Life Technologies | A32750 |
| MicroSpin G-25 columns | GE Healthcare | 27-5325-01 |
| Cytospin 2 | Shandon | 59900102 |
| Bovine Serum Albumin, Molecular Biology Grade (for hybridization buffer) | Roche | 10715859103 |
| Histone H3K27me3 antibody | Active Motif | 61017 |
| Accutase | Innovative Cell Technologies | AT104 |
| Alexa Fluor 555 Goat Anti-Mouse, highly cross-adsorbed | Life Technologies | A21424 |
| ProLong Gold antifade reagent | Life Technologies | P36931 |
References
- Payer, B., Lee, J. T. X chromosome dosage compensation: how mammals keep the balance. Annu Rev Genet. 42, 733-772 (2008).
- Lee, J. T. Gracefully ageing at 50, X-chromosome inactivation becomes a paradigm for RNA and chromatin control. Nat Rev Mol Cell Biol. 12, 815-826 (2011).
- Gendrel, A. V., Heard, E. Fifty years of X-inactivation research. Development. 138, 5049-5055 (2011).
- Froberg, J. E., Yang, L., Lee, J. T. Guided by RNAs: X-inactivation as a model for lncRNA function. J Mol Biol. 425, 3698-3706 (2013).
- Penny, G. D., Kay, G. F., Sheardown, S. A., Rastan, S., Brockdorff, N. Requirement for Xist in X chromosome inactivation. Nature. 379, 131-137 (1996).
- Marahrens, Y., Panning, B., Dausman, J., Strauss, W., Jaenisch, R. Xist-deficient mice are defective in dosage compensation but not spermatogenesis. Genes Dev. 11, 156-166 (1997).
- Clemson, C. M., McNeil, J. A., Willard, H. F., Lawrence, J. B. XIST RNA paints the inactive X chromosome at interphase: evidence for a novel RNA involved in nuclear/chromosome structure. J Cell Biol. 132, 259-275 (1996).
- Sado, T., Brockdorff, N. Advances in understanding chromosome silencing by the long non-coding RNA. Xist. Phil Trans R Soc B. 368, 20110325-20 (2013).
- Zhao, J., Sun, B. K., Erwin, J. A., Song, J. J., Lee, J. T. Polycomb proteins targeted by a short repeat RNA to the mouse X chromosome. Science. 322, 750-756 (2008).
- Plath, K., et al. Role of histone H3 lysine 27 methylation in X inactivation. Science. 300, 131-135 (2003).
- Silva, J., et al. Establishment of histone h3 methylation on the inactive X chromosome requires transient recruitment of Eed-Enx1 polycomb group complexes. Dev Cell. 4, 481-495 (2003).
- Gall, J. G. Differential synthesis of the genes for ribosomal RNA during amphibian oogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 60, 553-560 (1968).
- Femino, A. M., Fay, F. S., Fogarty, K., Singer, R. H. Visualization of single RNA transcripts in situ. Science. 280, 585-590 (1998).
- Raj, A., van den Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes. Nat Methods. 5, 877-879 (2008).
- Chaumeil, J., Augui, S., Chow, J. C., Heard, E. Combined immunofluorescence, RNA fluorescent in situ hybridization, and DNA fluorescent in situ hybridization to study chromatin changes, transcriptional activity, nuclear organization, and X-chromosome inactivation. Methods Mol Biol. 463, 297-308 (2008).
- Katayama, S., et al. Antisense transcription in the mammalian transcriptome. Science. 309, 1564-1566 (2005).
- Ogawa, Y., Xite Lee, J. T. X-inactivation intergenic transcription elements that regulate the probability of choice. Mol Cell. 11, 731-743 (2003).
- Panning, B. X inactivation in mouse ES cells: histone modifications and FISH. Methods Enzymol. 376, 419-428 (2004).
- Khalil, A. M., et al. Many human large intergenic noncoding RNAs associate with chromatin-modifying complexes and affect gene expression. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 11667-11672 (2009).
- Martin, G. R., Evans, M. J. Differentiation of clonal lines of teratocarcinoma cells: formation of embryoid bodies in vitro. Proc Natl Acad Sci U S A. 72, 1441-1445 (1975).
- Lee, J. T., Lu, N. Targeted mutagenesis of Tsix leads to nonrandom X inactivation. Cell. 99, 47-57 (1999).
- Zhang, L. F., et al. Telomeric RNAs mark sex chromosomes in stem cells. 유전학. 182, 685-698 (2009).
- Raj, A., Tyagi, S. Detection of individual endogenous RNA transcripts in situ using multiple singly labeled probes. Methods Enzymol. 472, 365-386 (2010).
- Kimura, H., Hayashi-Takanaka, Y., Goto, Y., Takizawa, N., Nozaki, N. The organization of histone H3 modifications as revealed by a panel of specific monoclonal antibodies. Cell Struct Funct. 33, 61-73 (2008).
- Ogawa, Y., Sun, B. K., Lee, J. T. Intersection of the RNA interference and X-inactivation pathways. Science. 320, 1336-1341 (2008).
- Kohlmaier, A., et al. A chromosomal memory triggered by Xist regulates histone methylation in X inactivation. PLoS Biol. 2, 171 (2004).
- Wang, K. C., Chang, H. Y. Molecular mechanisms of long noncoding RNAs. Mol Cell. 43, 904-914 (2011).
