Snabb Fluorescerande<em> In situ</em> Hybridisering protokollet för Xist RNA Kombinerad med Immunfluorescens av histonmodifiering i X-kromosomen Inaktive
Summary
We developed an easily customized strand-specific fluorescent in situ hybridization (FISH) protocol combined with immunofluorescence. This allows for a detailed examination of RNA dynamics with simultaneous insight into the chromatin structure, nuclear organization, and transcriptional regulation at the single cell level.
Abstract
Kombinera RNA fluorescent in situ hybridisering (FISH) med immunofluorescens (immun FISH) skapar en teknik som kan användas vid enstaka cellnivå för att upptäcka de rumsliga dynamiken i RNA lokalisering med samtidig insikt i lokalisering av proteiner, epigenetiska modifieringar och andra detaljer vilket kan belysas genom immunofluorescens. X-kromosom inaktive är ett paradigm för lång icke-kodande RNA (lncRNA) medierad geners uttryck. X-inaktiv specifika transkript (Xist) lncRNA ackumulation (kallas Xist moln) på en av de två X-kromosomer i däggdjurs honor är ett kritiskt steg för att initiera X-kromosom inaktive. Xist RNA direkt eller indirekt interagerar med olika kromatin-modifierande enzymer och introducerar distinkta epigenetiska landskap till den inaktiva X-kromosomen (Xi). En känd epigenetiska kännetecken för Xi är Histon H3 trimetyl-lysin 27 (H3K27me3) modifiering. Här beskriver vi en enkel och snabb immun FISHprotokoll för att upptäcka Xist RNA använder RNA FISH med flera oligonukleotidprober kombination med immunofluorescens av H3K27me3 att undersöka lokalisering av Xist RNA och tillhörande epigenetiska förändringar. Användning av oligonukleotidsonder resulterar i en kortare inkubationstid och känsligare detektion av Xist-RNA jämfört med in vitro transkriberade RNA-prober (riboprober). Protokollet ger ett kraftfullt verktyg för att förstå dynamiken i lncRNAs och dess tillhörande epigenetisk modifiering, kromatinstruktur, kärnkraft organisation och transkriptionsreglering.
Introduction
Däggdjur X-kromosom inaktive (XCI) är en strategi för att kompensera för obalansen i X-bunden gen dosering mellan XX och XY, där en av de två X-kromosomer i honor är transkriptioninaktiv 1. X-kromosom inaktive är en stor modellsystem för långa icke-kodande RNA (lncRNA) forskning. X-kromosom inaktive regleras av flera lncRNAs, och har studerats under de senaste decennierna för att avslöja de hörningsmekanismerna mellan lncRNAs, transkription, kromatinstruktur och kärnkraftsorganisation 2, 3.
X inaktivecenter (XIC) belägen på X-kromosomen är en komplex genetisk lokus består av ett antal gener som producerar icke-kodande RNA 4. X-inaktiv specifika transkript (Xist) lncRNA i eutherian däggdjur är en sådan lncRNA som spelar en avgörande roll i X-kromosomen inaktive 5,6. Xist transkripten omger platsen för fuTure Xi att initiera X-kromosom inaktive, och visas som ett moln när visualiseras med RNA FISH; denna formation kallas den "Xist Cloud" 7. Eftersom Xist RNA interagerar med olika kromatin-modifierande enzymer, är samlokalisering av Xist moln med olika epigenetiska modifieringar för tyst kromatin och repressiva transkription observeras under X-kromosom inaktive 8. Exempelvis Xist RNA interagerar med Polycomb repressiva komplex 2 (PRC2) som ansvarar för H3K27me3 och inducerar en repressiv kromatin tillstånd 9. Förekomsten av Xist molnet på Xi och dess samlokalisering med den intensiva H3K27me3 modifieringen innebär en frivillig heterokromatin landskapet i Xi 10,11.
Cytogenetiska tekniker, såsom DNA / RNA FISH har kommit långt från den traditionella metoden att använda radiomärkta prober 12 till senaste och avancerade tekniker med förbättrad känslighet ochfluorescerande avbildning med flera oligonukleotidprober 13,14. DNA / RNA FISH kombination med immunofluorescens har rutinmässigt används som ett cytologisk verktyg för att förstå spatiotemporal kärnkraftsorganisation, RNA lokalisering, kromatinstrukturen och modifieringar. Den mest standardprob förberedelse för RNA FISH innebär användning av plasmiden eller bakteriella artificiella kromosom (BAC) kloner och deras efterföljande märkning antingen med nicktranslation eller slumpmässig priming 15. Men nästan 70% av gener i möss och 40% av generna hos människa visar en överlappning av sinnes och antisense avskrifter 16, därför krävde ett strängspecifikt FISH metod för att skilja förnuft och antisense avskrifter. In vitro transkriberade RNA-sonder (riboprob ) används ofta för strängspecifik RNA FISH 17,18; Men handlar det om att förbereda en plasmidklon eller PCR-produkt med T7, SP6 eller T3 promotor och syntetiserande riboprober. Vidare riboprober härledd från Genometic DNA eller cDNA innehåller ofta ospecifika regioner och repetitiva element, vilket resulterar i höga bakgrundsljud. En annan fråga är att riboprober, som är några hundra nukleotider lång och innehåller flera fluoroforer, inte effektivt kan tränga in i kärnan. För att kringgå detta, har flera kortare oligonukleotidprober märkta med en enda fluorofor vid slutet utvecklats som har god känslighet, likformig signalstyrka, och enkel rening och hantering 14. Dessutom, DNA-oligonukleotider i allmänhet är mer stabil än RNA. Vi tillämpade en liknande strategi att använda oligonukleotider i Xist RNA FISH 19 med immunofluorescens för att förstå de epigenetiska dynamiken i Xi inducerade av Xist lncRNA under processen med X-kromosomen inaktivering. Detta protokoll beskriver skapandet av oligonukleotidprober och korrekt beredning av celler, samt utnyttjande av immunofluorescens och RNA FISH. Xist RNA FISH använda flera oligonucleotides är kostnadseffektivt tillvägagångssätt på lång sikt om Xist RNA FISH utförs rutinmässigt i en laboratorium. Denna teknik kan användas för att identifiera lncRNAs i celler samtidigt kartlägga sin samlokalisering med epigenetiska modifieringar eller faktorer. En stor fördel med protokollet är möjligheten att enkelt ändra den efter sina forskningsintressen.
Protocol
Representative Results
Discussion
I denna uppsats har vi presenterat en snabb immun FISH protokoll som tar mindre än 5 timmar att slutföra förberedelserna slide, Xist RNA FISH och immunofluorescens för H3K27me3. I jämförelse med den allmänna immun FISH strategi för Xist RNA upptäckt, som vanligtvis behöver övernattning inkubation för RNA FISH, detta protokoll inte bara avsevärt minskar tiden utan också förbättrar känsligheten hos immun FISH använder oligonukleotidprober.
Eftersom Xist starkt transkriberas u…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Hongjae Sunwoo for helpful advice for oligonucleotide design in RNA FISH. We also thank Serenity Curtis for editing the manuscript. N.Y. was supported by a Postdoctoral Fellowship for Research Abroad of the Japan Society for the Promotion of Science (JSPS). This work was supported by the NIH (RO1-GM102184), the March of Dimes Research Foundation (#6-FY12-337), and the Developmental Fund and Trustee Grant at Cincinnati Children’s Hospital Medical Center to Y.O.
Materials
| oligonucleotides with 5’-amine modification | IDT | |
| Alexa Fluor 488 Reactive Dye | Life Technologies | A32750 |
| MicroSpin G-25 columns | GE Healthcare | 27-5325-01 |
| Cytospin 2 | Shandon | 59900102 |
| Bovine Serum Albumin, Molecular Biology Grade (for hybridization buffer) | Roche | 10715859103 |
| Histone H3K27me3 antibody | Active Motif | 61017 |
| Accutase | Innovative Cell Technologies | AT104 |
| Alexa Fluor 555 Goat Anti-Mouse, highly cross-adsorbed | Life Technologies | A21424 |
| ProLong Gold antifade reagent | Life Technologies | P36931 |
References
- Payer, B., Lee, J. T. X chromosome dosage compensation: how mammals keep the balance. Annu Rev Genet. 42, 733-772 (2008).
- Lee, J. T. Gracefully ageing at 50, X-chromosome inactivation becomes a paradigm for RNA and chromatin control. Nat Rev Mol Cell Biol. 12, 815-826 (2011).
- Gendrel, A. V., Heard, E. Fifty years of X-inactivation research. Development. 138, 5049-5055 (2011).
- Froberg, J. E., Yang, L., Lee, J. T. Guided by RNAs: X-inactivation as a model for lncRNA function. J Mol Biol. 425, 3698-3706 (2013).
- Penny, G. D., Kay, G. F., Sheardown, S. A., Rastan, S., Brockdorff, N. Requirement for Xist in X chromosome inactivation. Nature. 379, 131-137 (1996).
- Marahrens, Y., Panning, B., Dausman, J., Strauss, W., Jaenisch, R. Xist-deficient mice are defective in dosage compensation but not spermatogenesis. Genes Dev. 11, 156-166 (1997).
- Clemson, C. M., McNeil, J. A., Willard, H. F., Lawrence, J. B. XIST RNA paints the inactive X chromosome at interphase: evidence for a novel RNA involved in nuclear/chromosome structure. J Cell Biol. 132, 259-275 (1996).
- Sado, T., Brockdorff, N. Advances in understanding chromosome silencing by the long non-coding RNA. Xist. Phil Trans R Soc B. 368, 20110325-20 (2013).
- Zhao, J., Sun, B. K., Erwin, J. A., Song, J. J., Lee, J. T. Polycomb proteins targeted by a short repeat RNA to the mouse X chromosome. Science. 322, 750-756 (2008).
- Plath, K., et al. Role of histone H3 lysine 27 methylation in X inactivation. Science. 300, 131-135 (2003).
- Silva, J., et al. Establishment of histone h3 methylation on the inactive X chromosome requires transient recruitment of Eed-Enx1 polycomb group complexes. Dev Cell. 4, 481-495 (2003).
- Gall, J. G. Differential synthesis of the genes for ribosomal RNA during amphibian oogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 60, 553-560 (1968).
- Femino, A. M., Fay, F. S., Fogarty, K., Singer, R. H. Visualization of single RNA transcripts in situ. Science. 280, 585-590 (1998).
- Raj, A., van den Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes. Nat Methods. 5, 877-879 (2008).
- Chaumeil, J., Augui, S., Chow, J. C., Heard, E. Combined immunofluorescence, RNA fluorescent in situ hybridization, and DNA fluorescent in situ hybridization to study chromatin changes, transcriptional activity, nuclear organization, and X-chromosome inactivation. Methods Mol Biol. 463, 297-308 (2008).
- Katayama, S., et al. Antisense transcription in the mammalian transcriptome. Science. 309, 1564-1566 (2005).
- Ogawa, Y., Xite Lee, J. T. X-inactivation intergenic transcription elements that regulate the probability of choice. Mol Cell. 11, 731-743 (2003).
- Panning, B. X inactivation in mouse ES cells: histone modifications and FISH. Methods Enzymol. 376, 419-428 (2004).
- Khalil, A. M., et al. Many human large intergenic noncoding RNAs associate with chromatin-modifying complexes and affect gene expression. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 11667-11672 (2009).
- Martin, G. R., Evans, M. J. Differentiation of clonal lines of teratocarcinoma cells: formation of embryoid bodies in vitro. Proc Natl Acad Sci U S A. 72, 1441-1445 (1975).
- Lee, J. T., Lu, N. Targeted mutagenesis of Tsix leads to nonrandom X inactivation. Cell. 99, 47-57 (1999).
- Zhang, L. F., et al. Telomeric RNAs mark sex chromosomes in stem cells. 유전학. 182, 685-698 (2009).
- Raj, A., Tyagi, S. Detection of individual endogenous RNA transcripts in situ using multiple singly labeled probes. Methods Enzymol. 472, 365-386 (2010).
- Kimura, H., Hayashi-Takanaka, Y., Goto, Y., Takizawa, N., Nozaki, N. The organization of histone H3 modifications as revealed by a panel of specific monoclonal antibodies. Cell Struct Funct. 33, 61-73 (2008).
- Ogawa, Y., Sun, B. K., Lee, J. T. Intersection of the RNA interference and X-inactivation pathways. Science. 320, 1336-1341 (2008).
- Kohlmaier, A., et al. A chromosomal memory triggered by Xist regulates histone methylation in X inactivation. PLoS Biol. 2, 171 (2004).
- Wang, K. C., Chang, H. Y. Molecular mechanisms of long noncoding RNAs. Mol Cell. 43, 904-914 (2011).
