운모의 준비 고해상도 광학 현미경 이미징 지질 이중층 지원

요약

우리는 고해상도 현미경 운모지지 지질 이중층을 제조하는 방법을 제시한다. 운모는 원자 규모에서 투명하고 평면이지만, 거의 때문에 어려움을 처리하는 영상에서 사용되지; 우리의 준비는 운모 시트도 증착 결과 및 이중층의 제조에 사용되는 물질을 감소시킨다.

초록

지원되는 지질 이중층 (SLB 수)가 널리 막 특성 (상 분리, 클러스터링, 역학)과 같은 약물이나 펩티드 등의 다른 화합물과의 상호 작용을 연구하기위한 모델로 사용된다. 그러나 SLB 특성 사용 지원에 따라 다르다.

SLB 이미징 및 측정에 일반적으로 사용되는 기술들은 단일 분자 형광 현미경, FCS 및 원자 힘 현미경 (AFM)이다. AFM은 매우 평탄한 표면 (일반적으로 운모)를 필요로하는 동안 대부분의 광학 이미징 연구가 유리 지지체 상에 실시되기 때문에 이들 재료의 충전 및 평활성 속성 강하게 확산 영향 때문에, 이러한 기술의 결과는, 직접 비교 될 수 없다. 불행하게도, 유리 슬라이드에 절단 및 운모의 얇은 조각을 접착제로 붙이기에 필요한 손재주의 높은 수준의 SLB 준비를위한 운모의 일상적인 사용에 장애물을 선물한다. 이 선택의 방법, 이러한 준비 운모 것입니다 있지만표면은 종종 특히 작은 작동 거리, 높은 수치 조리개 렌즈로, 요철 (물결 모양) 및 이미지에 어려운 끝나게. 여기에서 우리는 지질 소포 증착 및 SLB의 제조에 대해 얇고 편평한 운모 표면을 제조하기위한 간단하고 재현 가능한 방법을 제시한다. 또한, 우리의 사용자 정의 만든 챔버는 SLB 형성 소포 만 아주 작은 볼륨을 필요로합니다. AFM 연구에서 사용 된 것과 직접 필적 고품질 지질 이중층 표면의 효율적인 간단하고 저렴한 생산 전체적인 절차 결과.

서론

본 프로토콜의 전반적인 목표는 원자 힘과 결합 될 수있는 광학 전반사 형광 현미경 (TIRFM) 또는 공 초점 현미경을 이용한 운모지지 지질 이중층 (SLB 수)의 고해상도 영상화 운모 표면의 제조 방법을 도시하는 것이다 현미경 (AFM).

유동화 증권 지질 클러스터링, 상 분리, 펩티드, 단백질 또는 다른 화합물 ^1-5 이중층 구성 요소 또는 상호 작용의 역학의 수많은 연구를위한 널리 사용되는 모델입니다. 다른 기판은 SLB 형성 연구 ^4,6-8의 특성에 따라 (즉, 유리, 운모, 이산화 규소, 중합체)에 사용될 수있다. 분리막 연구는 TIRFM 및 AFM 같은 현미경을 기반 영상 기술에 의존하고 있습니다. 유리는 투명하기 때문에 이에 TIRFM 이미징, 유리 표면은 일반적인 선택이다. 유리의 제조가 비교적 용이하고, 결과의 품질은 주로이전에 지질 소포의 증착 청소 철저한 표면에 의해 결정된다. 높은 축 방향의 해상도에 의한 AFM은 운모 표면을 필요로한다. 운모는 완벽한 기초 분열 부근으로, 규산염 광물이다. 따라서, 갓 절단 운모 심지어 서브 - 나노 미터 스케일 ^(9)에 막 고저차의 관찰을 허용, 원자 적으로 평면이다.

프로토콜

1. 운모 및 슬라이드 준비

1. 장소 번호 1 ½ (0.17 mm)는 염색 랙에 커버 슬립.
2. 60 ° C에서 2 % 세제에 30 분 동안 초음파 처리
3. 탈 이온수로 20 회 반복한다.
4. 집게를 사용하여 슬라이드를 제거하고 압축 공기 또는 질소를 사용하여 건조한다.
5. 운모 시트를 가위 또는 면도날을 사용하여 10 × 10mm 사각형 조각으로 잘라.
6. 면도날을 사용하여 2 ~ 3 얇은 전단지에 각 운모 조각을 잘라.
   참고 :이 단계는 날카로운 칼날의 사용을 필요로합니다.

2. 운모 조립 및 장착 상공 회의소

1. 에탄올로 청소 현미경 유리 슬라이드.
2. 광학 접착제를 사용하여 유리 슬라이드에 단계 1.6 절단 운모의 접착제 전단지. 낮은 점도의 접착제가 더 강하를 확산하고 운모를 접착하는 것이 좋습니다.
3. , UV 램프에서 10 분을 치료.
   NOTE : 접착제는 350 ~ 380 ㎚의 범위에서 최대 흡수 및 requ의 추천 에너지로 UV 광에 의해 경화된다전체 치료를위한 IRED 4.5 J / ^㎠이다. 그러나, 다른 광원 (접착제 공급 업체에서 제....

결과

SLB 수있는 지질 형광 프로브의 확산 동작은 기판에 따라 다르다. SMT 기술과 결합 된 TIRFM는 입자의 움직임을 시각화하고 그들의 확산 계수를 추출하기위한 중요한 방법이다. DOPC 유리와 운모 지원 (1,2 - dioleoyl-SN-글리세로 -3 - 포스 포 콜린) 이중층에 확산 핑고 마이 엘린 - ATTO647N 프로브의 단일 분자 신호는 첨부 된 애니메이션 그림에 표시됩니다. 운모 표면은 여기에 제시된 프로토콜에 따라 제조 하였다. 광학 수차를 추정하기 위해, 반 최대 (FWHM)의 전체 폭을 측정하고 ^{16, 17 플러그인} 모자이크 2D PSF 크기 ImageJ에를 사용하여 20 점 확산 함수 (PSF)에 대해 평균 하였다. 유리와 운모의 측정 FWHM은 각각 441nm와 464nm (그림 1)이었다. 유리와 운모에 영상과 해상도의 22 나노의 차이는 중요하지 않습니다. 두 경우 모두, 각각의 단일 형광 분자의 PSF의 중심은 로카 수연속적인 프레임.......

토론

이 프로토콜은 지질 이중층 증착 및 고해상 이미징 부드럽고 얇은 운모 표면의 제조 방법을 설명한다. 기술은 주로 고품질 운모 표면을 얻기위한 중요한 유리 운모 - 유리 샌드위치 (단계 2.8)의 세세한 제외에 한정되는 최소한의 수동 기술을 필요로한다. 운모는 클 리빙없이 광학 접착제에서 분리하는 것이 가능하기 때문에 갓 절단 운모의 검사는 항상 광학 접착제의 노출 된 영역을 남기고,이 시점에서 필요하다. 즉, 접착제 대신에 운모의 이중층의 원치 않는 증착 될 수 있습니다. 운모 표면은 몇 가지 예외가 우리가 얻어진 균일하게 높은 광학 이미징 품질로 볼때, 커버 슬립의 표면에 평행하여 기재 한 방법은 사용하여 제조; 따라서 우리는 추가 검증을위한 필요성을하지 않았다.

챔버 설치의 마지막 단계는 사용자 정의 할 수 있습니다. 비디오 튜토리얼을 보여줍니다챔버로 사용되는 1.5 ㎖의 유리 병 플라스틱 캡은, 그러나이 유사한 모양의 개체를 원하는 크기로 대체 할 수있다 홀더와 샘플 A.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Bath Sonicator	Fisher Scientific	FB15051
커버 슬립 24 x 50mm - No H1.5	Marienfeld	102222
DOPC	Avanti Polar Lipids	850357
Hellmanex III (세제)	Hellma Analytics	320.003
Mica V-1 Grade	SPI Suppliers	1872-CA
광학 접착제 (높음) 점도)	Norland Products	NOA63
Optical Adhesive (저점도)	Norland Products	NOA60
Sphingomyelin-ATTO647N	AttoTec	AD 647N-171
UV lamp	Synoptics Ltd.	GelVue GVM20	램프가 100% 전력으로 설정되었습니다.