Osteoclasti derivazione dal midollo osseo di topo
Summary
Gli osteoclasti sono cellule che riassorbono l'osso principale nel corpo. La capacità di isolare osteoclasti in gran numero ha causato notevoli progressi nella comprensione della biologia osteoclasti. In questo protocollo, si descrive un metodo per l'isolamento, la coltivazione e quantificare l'attività degli osteoclasti in vitro.
Abstract
Gli osteoclasti sono cellule altamente specializzate che sono derivati dalla stirpe dei monociti / macrofagi del midollo osseo. La loro capacità unica di riassorbire sia le matrici organiche e inorganiche di osso significa che essi svolgono un ruolo chiave nella regolazione del rimodellamento scheletrico. Insieme, osteoblasti ed osteoclasti sono responsabili del processo di accoppiamento dinamico che coinvolge sia il riassorbimento osseo e la formazione ossea agendo insieme per mantenere lo scheletro normale durante salute e di malattia.
Poiché la cella di ossa riassorbimento principale del corpo, cambiamenti nella differenziazione o funzione osteoclasti possono provocare effetti profondi nel corpo. Malattie associate con la funzione degli osteoclasti alterata può variare in gravità da malattia neonatale letale a causa di fallimento per formare uno spazio osseo per emopoiesi, per osservare più comunemente patologie come l'osteoporosi, in cui un eccessivo riassorbimento osseo degli osteoclasti predispone alle fratture formazione.
ent "> La capacità di isolare osteoclasti in quantità elevata in vitro ha permesso significativi progressi nella comprensione del ciclo di rimodellamento osseo e ha aperto la strada per la scoperta di nuove strategie terapeutiche che combattere tali malattie.Qui, descriviamo un protocollo per isolare e coltivare osteoclasti da midollo osseo di topo che consentiranno di ottenere un gran numero di osteoclasti.
Introduction
Il rimodellamento osseo è dinamico e prevede l'accoppiamento della formazione ossea con riassorbimento osseo 1. Questo processo strettamente regolato è responsabile del mantenimento dello scheletro durante omeostasi normale, e in risposta a lesioni e malattie.
Gli osteoclasti sono cellule multinucleate, unici che sono in grado di riassorbimento sia le matrici organiche e inorganiche di osso. Gli osteoclasti sono derivati dalla stirpe dei monociti / macrofagi del midollo osseo 2-5. Anomalie nella funzione o formazione di osteoclasti può provocare una varietà di patologie cliniche, incluse condizioni comuni come l'osteoporosi.
La capacità di generare osteoclasti in vitro ha permesso significativi progressi nella nostra comprensione della biologia dell'osso 6. Di conseguenza, i nuovi agenti terapeutici stanno emergendo per curare le malattie degli osteoclasti correlate che sono responsabili di morbilità e mortalità significative 7 </sup>. Manutenzione omeostatico della massa ossea e la forza richiede l'azione concertata degli osteoblasti che formano l'osso e osteoclasti che riassorbono l'osso 8,9. Osso omeostasi è alterata in un certo numero di malattie, compreso postmenopausale, in cui l'aumento dell'attività degli osteoclasti porta alla perdita patogenicità di massa ossea e densità 10. Con l'aumento della disponibilità di transgenici modelli murini di malattie umane, non vi è più possibilità di decifrare il ruolo degli osteoclasti nelle malattie delle ossa umane 11-13.
Numerosi protocolli per tecniche di coltura degli osteoclasti appaiono in letteratura, con molte varianti descritte 9,12,14. Xing e colleghi descrivono la metodologia simile al protocollo descritto di seguito, nella loro descrizione di saggi osteoclastogenico da cellule del midollo osseo di topo. Tuttavia, per liberare le cellule del midollo osseo seguenti raccolta delle ossa lunghe, Xing et al. Lavare la cavità midollare con α-MEM multimediale completo14. Catalfamo esamina l'effetto dell'iperglicemia sulla funzione degli osteoclasti e descrive un metodo in cui tutte le cellule mobilizzano midollo osseo lavaggio sono coltivate per 24 ore, a questo punto le cellule non aderenti sono scartati 12, una tecnica usata anche da Boyle et al . 9 Questi protocolli precedentemente pubblicati richiedono la pratica di lavaggio del midollo osseo, una pratica noiosa, che introduce anche il rischio di ferirsi e la perdita di preziose midollo osseo, come si deve tagliare entrambe le estremità dell'osso. Il protocollo, che descriveremo, implementa l'utilizzo di un mortaio e pestello per isolare osteoclasti, che è simile al metodo di isolamento macrofagi descritto da Weischenfeldt et al. 15
La nostra esperienza, tuttavia, è che l'isolamento degli osteoclasti e la coltura in vitro utilizzando tecniche precedentemente pubblicati dà risultati variabili in termini di produzione di osteoclasti, che spesso portain una incapacità di coltivare osteoclasti. Pertanto, abbiamo ideato un protocollo che consente l'isolamento uniforme del midollo osseo di topo per produrre un gran numero di osteoclasti multinucleate in vitro, con una resa approssimativa del 70-80% delle cellule inizialmente placcati formando macrofagi e successivamente osteoclasti, in presenza di mezzi di induzione degli osteoclasti.
Protocol
Representative Results
Discussion
La capacità di isolare facilmente e coltivare un gran numero di osteoclasti in vitro è stato responsabile per aver contribuito a promuovere la comprensione della biologia dell'osso e delle malattie degli osteoclasti-mediata. Era l'identificazione di RANKL che portano a questo, quando è stato recentemente identificato come il principale regolatore della formazione degli osteoclasti, differenziamento e la sopravvivenza 16-18.
E 'stata la nostra esperienza che…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Riconosciamo il sostegno di borse di studio NIH R01 DE021683, DE019434 R01, U01 HL099776, della Fondazione Oak e il Laboratorio Hagey Pediatrica Medicina Rigenerativa.
Materials
| Name of the Material/Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| MEM, no glutamine, no phenol red | Gibco | 51200-038 | |
| M-CSF, recombinant mouse | Gibco | PMC2044 | |
| Recombinant Mouse TRANCE/RANK L/TNFSF11 (E. coli expressed) | R&D Systems | 462-TEC-010 | |
| Prostaglandin E2 | Sigma-Aldrich | ||
| Histopaque-1077 | Sigma-Aldrich | 10771 | |
| Acid Phosphatase, Lekocyte (TRAP) kit | Sigma-Aldrich | 387A | |
| Osteoassay bone resorption plates, 24 well plates | Corning Life Sciences | 3987 |
References
- Sims, N. A., Martin, T. J. Coupling the activities of bone formation and resorption: a multitude of signals within the basic multicellular unit. BoneKEy reports. 3, 481 (2014).
- Kahn, A. J., Simmons, D. J. Investigation of cell lineage in bone using a chimaera of chick and quial embryonic tissue. Nature. 258, 325-327 (1975).
- Walker, D. G. Bone resorption restored in osteopetrotic mice by transplants of normal bone marrow and spleen cells. Science. 190, 784-785 (1975).
- Burger, E. H., et al. In vitro formation of osteoclasts from long-term cultures of bone marrow mononuclear phagocytes. The Journal of experimental medicine. 156, 1604-1614 (1982).
- Underwood, J. C. From where comes the osteoclast. The Journal of pathology. 144, 225-226 (1984).
- Lacey, D. L., et al. Bench to bedside: elucidation of the OPG-RANK-RANKL pathway and the development of denosumab. Nature reviews. Drug discovery. 11, 401-419 (2012).
- Brown, J. E., Coleman, R. E. Denosumab in patients with cancer-a surgical strike against the osteoclast. Nature reviews. Clinical oncology. 9, 110-118 (2012).
- Khosla, S. Minireview: the OPG/RANKL/RANK system. Endocrinology. 142, 5050-5055 (2001).
- Boyle, D. L., et al. Differential roles of MAPK kinases MKK3 and MKK6 in osteoclastogenesis and bone loss. PloS one. 9, (2014).
- Hofbauer, L. C., Heufelder, A. E. Role of receptor activator of nuclear factor-kappaB ligand and osteoprotegerin in bone cell biology. Journal of molecular medicine (Berlin, Germany). 79, 243-253 (2001).
- Teramachi, J., et al. Increased IL-6 Expression in Osteoclasts is Necessary but not Sufficient for the Development of Paget’s Disease of Bone. Journal of bone and mineral research : the official journal of the American Society for Bone and Mineral Research. , (2013).
- Catalfamo, D. L., et al. Hyperglycemia induced and intrinsic alterations in type 2 diabetes-derived osteoclast function. Oral diseases. 19, 303-312 (2013).
- Schueler, J., et al. Intratibial injection of human multiple myeloma cells in NOD/SCID IL-2Rgamma(null) mice mimics human myeloma and serves as a valuable tool for the development of anticancer strategies. PloS one. 8, (2013).
- Xing, L., Boyce, B. F. RANKL-Based Osteoclastogenic Assays from Murine Bone Marrow Cells. Methods in molecular biology (Clifton, N.J). 1130, 307-313 (2014).
- Weischenfeldt, J., Porse, B. Bone Marrow-Derived Macrophages (BMM): Isolation and Applications. CSH protocols. , (2008).
- Yamamoto, Y., et al. Osteoblasts provide a suitable microenvironment for the action of receptor activator of nuclear factor-kappaB ligand. Endocrinology. 147, 3366-3374 (2006).
- Yasuda, H., et al. Osteoclast differentiation factor is a ligand for osteoprotegerin/osteoclastogenesis-inhibitory factor and is identical to TRANCE/RANKL. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 3597-3602 (1998).
- Lacey, D. L., et al. Osteoprotegerin ligand is a cytokine that regulates osteoclast differentiation and activation. Cell. 93, 165-176 (1998).
- Teitelbaum, S. L., Ross, F. P. Genetic regulation of osteoclast development and function. Nature reviews. Genetics. 4, 638-649 (2003).
- Agas, D., Sabbieti, M. G., Marchetti, L. Endocrine disruptors and bone metabolism. Archives of toxicology. 87, 735-751 (2013).
- Manolagas, S. C., O’Brien, C. A., Almeida, M. The role of estrogen and androgen receptors in bone health and disease. Nature Reviews Endocrinology. 9, 699-712 (2013).
- Martin, T. J., Udagawa, N. Hormonal regulation of osteoclast function. Trends in endocrinology and metabolism. 9, 6-12 (1998).
- Nakamura, T., et al. Estrogen prevents bone loss via estrogen receptor alpha and induction of Fas ligand in osteoclasts. Cell. 130, 811-823 (2007).
- Bellido, T., et al. Regulation of interleukin-6, osteoclastogenesis, and bone mass by androgens. The role of the androgen receptor. The Journal of clinical investigation. 95, 2886-2895 (1995).
- Roato, I. Interaction among cells of bone, immune system, and solid tumors leads to bone metastases. Clinica., & developmental immunology. 2013, (2013).
- Autio, K. A., Morris, M. J. Targeting bone physiology for the treatment of metastatic prostate cancer. Clinical advances in hematolog., & oncology. 11, 134-143 (2013).
- Sottnik, J. L., Keller, E. T. Understanding and targeting osteoclastic activity in prostate cancer bone metastases. Current molecular medicine. 13, 626-639 (2013).
