Osteoklast Härledning från benmärg från mus

Summary

Osteoklaster är den huvudsakliga benresorberande cell i kroppen. En förmåga att isolera osteoklaster i stort antal har lett till betydande framsteg i förståelsen av osteoklaster biologi. I detta protokoll, beskriver vi en metod för isolering, odling och kvantifiera osteoklastaktivitet in vitro.

Abstract

Osteoklaster är specialiserade celler som härrör från monocyter / makrofager härstamning av benmärgen. Deras unika förmåga att resorberas både organiska och oorganiska matriser av ben gör att de spelar en viktig roll i regleringen av skelett ombyggnad. Tillsammans, osteoblaster och osteoklaster är ansvariga för den dynamiska kopplingen process som involverar både benresorption och benbildning agerar tillsammans för att upprätthålla den normala skelettet under hälsa och sjukdom.

Som den huvudsakliga benresorberande cell i kroppen, kan förändringar i osteoklastdifferentiering eller funktion resultera i djupgående effekter i kroppen. Sjukdomar associerade med förändrad osteoklaster funktionen kan variera i svårighetsgrad från dödlig neonatal sjukdom på grund av underlåtenhet att bilda en märgutrymme för blodbildningen, mer vanligt förekommande sjukdomar som benskörhet, där överdriven osteoklastisk benresorption ökar risken för sprickbildning.

ent "> En förmåga att isolera osteoklaster i stora mängder in vitro har gjort betydande framsteg i förståelsen av benremodellering cykeln och har banat väg för upptäckten av nya terapeutiska strategier som bekämpa dessa sjukdomar.

Här beskriver vi ett protokoll för att isolera och odla osteoklaster från musbenmärg som kommer att ge ett stort antal osteoklaster.

Introduction

Benremodellering är dynamisk och involverar kopplingen av benbildning med benresorption ^1. Denna hårt reglerad process ansvarar för att upprätthålla skelettet under normal homeostas, och som svar på skada och sjukdom.

Osteoklaster är unika, multinukleära celler som har förmåga att resorberande både de organiska och oorganiska matriser av ben. Osteoklaster härrör från monocyter / makrofager härstamning av benmärgen ^2-5. Avvikelser i funktion eller bildning av osteoklaster kan resultera i en mängd olika kliniska patologier, inklusive vanliga tillstånd som osteoporos.

Förmågan att generera osteoklaster in vitro har möjliggjort betydande framsteg i vår förståelse av skelettbiologi ^6. Som ett resultat, är nya terapeutiska medel utvecklas för att behandla osteoklast relaterade sjukdomar som är ansvariga för betydande sjuklighet och dödlighet ⁷ </supp>. Homeostatiska underhåll av benmassa och styrka kräver samordnade insatser av benbildande osteoblaster och benresorberande osteoklaster ^8,9. Benhomeostas förändras på ett antal sjukdomar, bland postmenopausal osteoporos, där ökad osteoklastaktivitet leder till patogena förlust av benmassa och densitet ^10. Med ökande tillgången av transgena musmodeller av human sjukdom, det finns större möjlighet att dechiffrera rollen av osteoklasterna i human skelettsjukdom ^11-13.

Talrika protokoll för osteoklast odlingstekniker visas i litteraturen, med många variationer beskrivs ^9,12,14. Xing och kollegor beskriver liknande metoder protokollet som beskrivs nedan, i sin beskrivning av osteoclastogenic analyser från murina benmärgsceller. Emellertid för att frigöra de benmärgsceller Följande rörben skörd, Xing et al. Spola märgen kavitet med α-MEM komplett medium^14. Catalfamo undersöker effekten av hyperglykemi på osteoklast funktion och beskriver en metod i vilken alla celler mobiliseras genom benmärgs spolning odlas under 24 h, vid vilken punkt de icke-vidhäftande cellerna kasseras ^12, en teknik som också används av Boyle et al . ⁹ Dessa tidigare publicerade protokoll kräver bruket att spola benmärgen, en mödosam metoder, vilket också medför en risk för en stickskada och förlust av värdefull benmärg, som man måste skära båda ändarna av benet. Det protokoll, som vi beskriver, implementerar användning av en mortel och mortelstöt för att isolera osteoklaster, som är likartad med metoden enligt makrofag isolering beskrives av Weischenfeldt et al., ¹⁵

Vår erfarenhet är dock att osteoklaster isolering och odling in vitro med hjälp av tidigare publicerade tekniker ger variabla utfall i termer av osteoklasterna produktion, vilket ofta lederi en oförmåga att odla osteoklaster. Därför har vi tagit fram ett protokoll som möjliggör konsekvent isolering av mus benmärgen att producera ett stort antal multinukleära osteoklaster in vitro, med en ungefärlig avkastning på 70-80% av cellerna initialt pläterade bildar makrofager och därefter osteoklaster, i närvaro av osteoklast induktionsmedia.

Protocol

OBS: Etiska riktlinjer: All forskning på ryggradsdjur har utförts enligt protokollen godkänts av Stanford administrativa panelen för Laboratory Animal Care (APLAC). 1. Förberedelser Tillåt 10 ml kommersiellt tillgänglig densitetsgradient cellseparationsmedia (som innehåller polysackaros och natrium-diatrizoat, justerades till en densitet av 1,077 g / ml) för att komma till RT i ett 50 ml koniskt rör. Förbered flödescytometri (FACS) buffert med 1x fosfatbuffrad saltlösning (PBS) …

Representative Results

Syftet med denna metod var att lätt isolera ett stort antal osteoklaster in vitro, typiskt i en vecka. Framgångsrik isolering av stora antal osteoklaster bekräftades med användning av tartrat-resistent surt fosfatas-färgning (Figur 1A). Stora osteoklaster visualiseras som stora lila celler med flera kärnor (typiskt ≥ 3 kärnor). Med hjälp av detta protokoll, är det vanligt att isolera osteoklaster med så många som 30 kärnor per osteoklaster (Figur 1B). <p…

Discussion

En möjlighet att enkelt isolera och odla ett stort antal osteoklaster in vitro har ansvarat för att hjälpa till att främja förståelse av ben biologi och osteoklastförmedlad sjukdomar. Det var identifieringen av RANKL som leder till detta, när det var nyligen identifierats som den huvudsakliga regulatorn av osteoklastbildning, differentiering och överlevnad ^16-18.

Det har varit vår erfarenhet att odling av osteoklaster från benmärg in vitro är till st…

Materials

Name of the Material/Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
MEM, no glutamine, no phenol red	Gibco	51200-038
M-CSF, recombinant mouse	Gibco	PMC2044
Recombinant Mouse TRANCE/RANK L/TNFSF11 (E. coli expressed)	R&D Systems	462-TEC-010
Prostaglandin E2	Sigma-Aldrich
Histopaque-1077	Sigma-Aldrich	10771
Acid Phosphatase, Lekocyte (TRAP) kit	Sigma-Aldrich	387A
Osteoassay bone resorption plates, 24 well plates	Corning Life Sciences	3987