फ्लोरोसेंट नैनोकणों के अनुप्रयोग Intracellular जीवाणुओं द्वारा इंडो-लाइसोसोमल प्रणाली के पुनर्गठन का अध्ययन करने के लिए
Summary
यह लेख संश्लेषण और नैनोकणों के फ्लोरोसेंट लेबलिंग (एनपीएस) के लिए तरीकों का वर्णन है। एनपीएस यूकेरियोटिक कोशिकाओं के एंडो-लाइसोसोमल प्रणाली लेबल करने के लिए पल्स-पीछा प्रयोगों में लागू किया गया। इंट्रासेल्युलर रोगज़नक़ सैल्मोनेला एन्ट्रिका की गतिविधियों से एंडो-लाइसोसोमल प्रणाली का हेरफेर लाइव सेल इमेजिंग और मात्रा द्वारा पीछा किया गया था।
Abstract
वांछनीय रासायनिक, ऑप्टिकल और यांत्रिक गुणों के साथ फ्लोरोसेंट नैनोकणों (एनपीएस) के intracellular organelles के लेबल करने के लिए होनहार उपकरण हैं। यहाँ, हम कोशिकाओं के एंडो-लाइसोसोमल सिस्टम लेबल और intracellular रोगज़नक़ सैल्मोनेला एन्ट्रिका द्वारा मेजबान सेलुलर रास्ते में से जोड़तोड़ की निगरानी के लिए सोने-बीएसए-rhodamine एनपीएस का उपयोग कर एक विधि परिचय। एनपीएस आसानी देर endosomes / लाइसोसोम में हेला कोशिकाओं द्वारा भली भाँति और स्थानीय थे। साल्मोनेला संक्रमण Salmonella- प्रेरित झिल्ली संरचनाओं में vesicles और एनपीएस के संचय की पुनर्व्यवस्था प्रेरित किया। हम confocal माइक्रोस्कोपी छवियों के मात्रात्मक विश्लेषण के लिए Imaris सॉफ्टवेयर पैकेज को तैनात किया। वस्तुओं की संख्या और गैर संक्रमित कोशिकाओं में उनके आकार के वितरण अत्यंत गुम्मट साल्मोनेला से एंडो-लाइसोसोमल प्रणाली के पुनर्गठन का संकेत है, साल्मोनेला -infected कोशिकाओं में लोगों से अलग थे।
Introduction
आदि धातु एनपीएस, क्वांटम डॉट्स, बहुलक एनपीएस, सिलिका एनपीएस, कार्बन डॉट्स, सहित फ्लोरोसेंट नैनोकणों (एनपीएस), पिछले दशकों 1,2 के दौरान काफी ध्यान आकर्षित किया है। परंपरागत जैविक रंगों की तुलना में, फ्लोरोसेंट एनपीएस ऐसी मजबूत सिग्नल की शक्ति, प्रतिरोध photobleaching करने और उच्च biocompatibility के 3,4 के रूप में वांछनीय रासायनिक, ऑप्टिकल और यांत्रिक गुणों, दिखाते हैं। ये लाभ उन्हें इंट्रासेल्युलर संवेदन और लाइव सेल इमेजिंग के लिए पसंद की विधि बनाते हैं। इसके अलावा, इलेक्ट्रॉन घने एनपीएस की एक किस्म ईएम 5 के साथ ultrastructural स्तर पर प्रकाश माइक्रोस्कोपी (एल एम) और उच्च संकल्प के साथ नज़र रखने के जीवित कोशिका के संयोजन की अनुमति देता है जो सहसंबद्ध सूक्ष्म विश्लेषण के लिए उनके उपयोग को सुविधाजनक बनाने, इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (ईएम) द्वारा दिखाई दे रहे हैं। उदाहरण के लिए, सोने एनपीएस कुशलता से संवेदनशील निदान के लिए जीवित कोशिकाओं में के रूप में अच्छी तरह से इम्युनो-लेबलिंग 6 के क्षेत्र में biosensors के रूप में इस्तेमाल लंबे समय के लिए किया गया है। हाल ही में एसtudies अलग आकार और आकार के साथ सोने एनपीएस सेल लाइनों की एक बड़ी विविधता से तेज और नियमित endosomal मार्ग के माध्यम से परिवहन, इसलिए महान क्षमता से किया जा रहा इंट्रासेल्युलर पुटिका परिवहन ट्रैकिंग और एंडो-लाइसोसोमल प्रणाली लेबलिंग के लिए आवेदन किया है आसानी से किया जा सकता है संकेत मिलता है कि 7,8 ।
ऐसे सैल्मोनेला एन्ट्रिका, शिगेला flexneri और लिस्टेरिया monocytogenes के रूप में माइक्रोबियल रोगज़नक़ों, गैर phagocytic मेजबान कोशिकाओं 9 आक्रमण करने के लिए अलग तंत्र विकसित किया है। भली भाँति किया जा रहा है के बाद, रोगज़नक़ों, या तो cytosol में स्थानीयकृत या झिल्ली ही सीमित डिब्बों में तनहा, उनके मेजबान वातावरण के साथ बड़े पैमाने पर बातचीत करने और अपने स्वयं के अस्तित्व के 10 एहसान करने के लिए इन मिलाना। उदाहरण के लिए, सैल्मोनेला एन्ट्रिका रहता है और एक intracellular phagosomal डिब्बे संक्रमण 11 पर साल्मोनेला युक्त रिक्तिका (SCV) करार दिया भीतर replicates। परिपक्व SCV, गॉल्जीकाय की ओर traffics endocytic मार्ग के साथ निरंतर बातचीत के दौर से गुजर, और ऐसे साल्मोनेला -induced तंतु के रूप में व्यापक ट्यूबलर संरचनाओं, (SIF), nexin नलिकाओं छँटाई, साल्मोनेला -induced स्रावी वाहक झिल्ली प्रोटीन 3 (SCAMP3) नलिकाओं, आदि के गठन लाती । 12-14। इन बैक्टीरियल रोगज़नक़ों मेजबान सेल रास्ते में हेरफेर अध्ययन कैसे समझ संक्रामक रोग के लिए आवश्यक है।
इधर, सोना-बीएसए-rhodamine एनपीएस मेजबान सेलुलर एंडो-लाइसोसोमल प्रणाली लेबल करने के लिए तरल पदार्थ ट्रेसर के रूप में इस्तेमाल किया गया है, और मानव जठरांत्र रोगज़नक़ सैल्मोनेला एन्ट्रिका serovar ताकि (साल्मोनेला) के साथ रोगज़नक़ की बातचीत का अध्ययन करने के लिए एक मॉडल के जीवाणु के रूप में इस्तेमाल किया गया था endocytic मार्ग की मेजबानी। गुम्मट साल्मोनेला या उत्परिवर्ती उपभेदों से संक्रमित गैर संक्रमित कोशिकाओं और कोशिकाओं में intracellular सोने-बीएसए-rhodamine एनपीएस एक confocal लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप (CLSM) ने उतारी थे।तब Imaris सॉफ्टवेयर साल्मोनेला संक्रमण endosomes / लाइसोसोम के चरम पुनर्व्यवस्था प्रेरित यह दर्शाता है कि एनपीएस के वितरण यों के लिए इस्तेमाल किया गया था। इस विधि का वर्णन के बाद, अनुरूप प्रयोगों भाँति एनपीएस की लंबी अवधि के भाग्य को ट्रैक करने और कोशिकाओं के endocytic मार्ग पर विभिन्न बहिर्जात पदार्थ या अंतर्जात कारकों के प्रभाव की जांच के लिए तैयार किया जा सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
स्तनधारी कोशिकाओं के एंडो-लाइसोसोमल प्रणाली पोषक तत्व अवशोषण, हार्मोन की मध्यस्थता संकेत पारगमन, प्रतिरक्षा निगरानी, और प्रतिजन प्रस्तुति 17 सहित महत्वपूर्ण शारीरिक प्रक्रियाओं, नियंत्रित कर…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Deutsche Forschungsgemeinschaft by grant Z within Sonderforschungsbereich 944 ‘Physiology and Dynamics of Cellular Microcompartments’ and HE1964/18 within priority program 1580.
Materials
| Name of the Material/Equipment | Company | Catalog Number | Comments/ Description |
| Gold chloride | Sigma-Aldrich | 520918 | |
| Tannic acid | Sigma-Aldrich | 403040 | |
| tri-sodium citrate | Sigma | C8532 | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A2153 | |
| NHS-Rhodamine | Pierce | 46406 | |
| DMSO | Sigma | D8418 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Gentamicin | Applichem | A1492 | |
| Kanamcyin | Roth | T832 | |
| Carbenicillin | Roth | 6344 | |
| 8-well chamber slides | Ibidi | 80826 | tissue culture treated, sterile |
| Imaris Software | Bitplane | version 7.6 | various configurations available |
References
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