Aplicación de nanopartículas fluorescentes para estudiar Remodelación del Sistema Endo-lisosomal por bacterias intracelulares
Summary
Este artículo describe métodos para la síntesis y marcaje fluorescente de nanopartículas (NPs). Los NPs se aplicaron en los experimentos de pulso-caza para etiquetar el sistema de endo-lisosomal de las células eucariotas. La manipulación del sistema de endo-lisosomal por las actividades del patógeno intracelular Salmonella enterica fueron seguidos por imágenes de células vivas y cuantificada.
Abstract
Nanopartículas fluorescentes (PN) con química deseable, propiedades ópticas y mecánicas son herramientas prometedoras para etiquetar orgánulos intracelulares. Aquí, presentamos un método que utiliza oro-BSA-rodamina PN para etiquetar el sistema endo-lisosomal de las células eucariotas y supervisar la manipulación de las vías celulares de acogida por el patógeno intracelular Salmonella enterica. Los parlamentos nacionales se internalizan fácilmente por las células HeLa y localizados en endosomas tardíos / lisosomas. Infección por Salmonella indujo reordenamiento de las vesículas y la acumulación de los PN en estructuras de membrana Salmonella inducidos. Desplegamos el paquete de software Imaris para análisis cuantitativos de imágenes de microscopía confocal. El número de objetos y su distribución de tamaño en las células no infectadas eran distintos de los de las células infectadas por Salmonella, lo que indica extremadamente remodelación del sistema de endo-lisosomal por WT Salmonella.
Introduction
Nanopartículas fluorescentes (PN), incluidos los PN de metal, puntos cuánticos, polímeros PN, PN sílice, puntos de carbono, etc., han atraído una atención considerable durante las últimas décadas 1,2. En comparación con los tintes orgánicos tradicionales, NPs fluorescentes muestran propiedades químicas deseables, ópticas y mecánicas, tales como fuerte intensidad de la señal, la resistencia a photobleaching y alta biocompatibilidad 3,4. Estas ventajas que el método de elección para la detección intracelular y imágenes de células vivas hacen. Además, una variedad de NPs electrón-densos son visibles por microscopía electrónica (EM), facilitando su uso para el análisis microscópico correlacionada, que permite la combinación de células vivas de seguimiento con microscopía de luz (LM) y mayor resolución a nivel ultraestructural con EM 5. Por ejemplo, los NPs de oro han sido mucho tiempo utilizado eficientemente como biosensores en células sensibles para el diagnóstico de vida, así como en el campo de la inmuno-etiquetado 6. S recientesos estudios indican que NP de oro con diferente tamaño y forma pueden ser fácilmente captación por una gran variedad de líneas celulares y transportar de forma rutinaria a través de la vía endosomal, por lo tanto tienen un gran potencial de ser aplicado para el seguimiento de la vesícula de transporte intracelular y el sistema de etiquetado endo-7,8 lisosomal .
Patógenos microbianos, como Salmonella enterica, Shigella flexneri y Listeria monocytogenes, se han desarrollado diferentes mecanismos para invadir las células huésped no fagocíticas 9. Después de ser interiorizado, los agentes patógenos, ya sean localizadas en el citosol o secuestradas en compartimentos de membrana, interactuando con su entorno de acogida y modulan estos para favorecer su propia supervivencia 10. Por ejemplo, Salmonella enterica reside y se replica dentro de un compartimiento intracelular phagosomal denomina -Con vacuola Salmonella (SCV) después de la infección 11. El SCV maduracióntráficos hacia el aparato de Golgi, sufriendo continuas interacciones con la vía endocítica, e induce la formación de estructuras tubulares extensos, tales como Salmonella filamentos inducidos (SIF), clasificación túbulos nexina, Salmonella portadoras secretora inducida por proteínas de membrana (3) SCAMP3 túbulos, etc. . 12-14. Estudiando cómo estos patógenos bacterianos manipulan las vías de la célula huésped es esencial para la comprensión de las enfermedades infecciosas.
Aquí, NPs de oro-BSA-rodamina fueron utilizados como trazadores de fluidos para etiquetar el sistema de endo-lisosomal celular del huésped, y el patógeno gastrointestinal Salmonella enterica serovar Typhimurium humana (Salmonella) se utilizó como un modelo de bacteria para estudiar las interacciones del patógeno con la acoger vía endocítica. PN oro-BSA-rodamina intracelular en las células no infectadas y las células infectadas con WT Salmonella o cepas mutantes se obtuvieron imágenes de un microscopio de escaneo láser confocal (CLSM).Entonces software Imaris se utilizó para cuantificar la distribución de los NPs, lo que indica que la infección por Salmonella inducida reordenamiento extremo de los endosomas / lisosomas. Después de la descripción de este método, los experimentos análogos pueden ser diseñados para rastrear el destino a largo plazo de los NPs internalizadas y para investigar la influencia de diferentes sustancias exógenas o factores endógenos en la vía endocítica de las células eucariotas.
Protocol
Representative Results
Discussion
El sistema de endo-lisosomal de las células de mamíferos controles importantes procesos fisiológicos, incluyendo la absorción de nutrientes, la transducción de señales mediada por la hormona, la vigilancia inmune, y la presentación de antígeno 17. Hasta ahora, una variedad de marcadores se han utilizado para el etiquetado de los estudios de la vía endocítica y seguimiento. Por ejemplo, las sondas son sondas LysoTracker acidotropic fluorescentes desarrollados por Molecular Probes (Life Technologies, …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Deutsche Forschungsgemeinschaft by grant Z within Sonderforschungsbereich 944 ‘Physiology and Dynamics of Cellular Microcompartments’ and HE1964/18 within priority program 1580.
Materials
| Name of the Material/Equipment | Company | Catalog Number | Comments/ Description |
| Gold chloride | Sigma-Aldrich | 520918 | |
| Tannic acid | Sigma-Aldrich | 403040 | |
| tri-sodium citrate | Sigma | C8532 | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A2153 | |
| NHS-Rhodamine | Pierce | 46406 | |
| DMSO | Sigma | D8418 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Gentamicin | Applichem | A1492 | |
| Kanamcyin | Roth | T832 | |
| Carbenicillin | Roth | 6344 | |
| 8-well chamber slides | Ibidi | 80826 | tissue culture treated, sterile |
| Imaris Software | Bitplane | version 7.6 | various configurations available |
References
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