ゼブラフィッシュは、脊椎動物の発生過程とモデルヒト疾患を研究するための優れた実験的な生物である。ここでは、読み出しをホールマウントin situハイブリダイゼーション (WISH)とゼブラフィッシュ胚で手動ハイスループット化学画面を実行する方法についてのプロトコルを記述します。
ゼブラフィッシュは、人間との遺伝的保全の彼らはかなりの程度まで広く使用されているモデル生物発生生物学の基礎となるメカニズムを調査すると、ヒトの疾患の病理を研究するようになった。化学遺伝学、生物学的プロセスに小分子が有する効果を試験し、治療化合物を同定するための人気のあるトランスレーショナルリサーチ方法になってきていることを伴う。ゼブラフィッシュは、特にため、外部から受精された胚の透明の大きなクラッチを産生する能力の化学遺伝学のために使用することが魅力的。さらに、ゼブラフィッシュ胚は、簡単に胚メディアへの化合物の単純な加算によって治療薬することができます。 in situハイブリダイゼーション (WISH) でホールマウントを使用して、mRNA発現は、明らかにゼブラフィッシュ胚内で可視化することができる。一緒に、化学遺伝学およびWISHを使用して、ゼブラフィッシュは細胞および生理学を決定する中で強力な生物全体のコンテキストになり小分子の効果。革新的な進歩は、しかし、そのようなオプションにアクセスできないか、費用対法外残る多くのラボのために、マシンベースのスクリーニング法を利用しての技術で作られてきた。ここに記載されているプロトコルは、基本的なリソースを必要とし、時間の効率的な期間内に、単一の個人または少人数のチームによって達成することができる手動のハイスループット化学遺伝学的スクリーニングを実行する方法について説明します。したがって、このプロトコルは、発生過程、病気のメカニズムに根本的な洞察を得るために有用であることができ、医学的に関連の用途を有する新規化合物とシグナル伝達経路を同定するためにゼブラフィッシュの化学遺伝学を実行するための研究グループによって実施することができる実行可能な戦略を提供。
人間の病気を治療する有効な治療薬の同定は、多くの生物医学研究者にとって大詰めです。臨床応用のための潜在的な薬理学的物質の同定および特徴は、医療用の明白な値を有しているが、それは重要な課題となってきた。最終的に、多くの治療化合物の開発は、開発または機能のいずれかを特定の細胞型の知識から来る。ゼブラフィッシュ、 ゼブラフィッシュは 、発生生物学1における主流のモデル生物となっているコイ科ファミリーの淡水硬骨魚である。ゼブラフィッシュは、遺伝的に維持し、科学的研究のために2,3、操作が簡単で扱いやすい脊椎動物である。ゼブラフィッシュ胚は、外部から受精、透明であり、一週間に2,3つの成人の交配対から数百により製造することができる。さらに、ゼブラフィッシュシェア主要な器官系と大きなDを所有ヒトを含む哺乳動物4、との遺伝的類似性のegree。驚くべきことに、ヒト遺伝子の70%は、ゼブラフィッシュオルソログ4を持っている。これにより類似性のために、ゼブラフィッシュは脊椎動物の発生および生理機能のメカニズムを研究するための非常に関連の実験系であった、そしてヒト疾患5-7多数を再現するために使用されている。これらの理由は、とりわけ、遺伝的尋問を継続するためにゼブラフィッシュの理想的な候補を作ったし、生物医学研究6,7におけるゼブラフィッシュの有用性のために着実に増加して感謝の意をもたらした。
過去数十年にわたり、遺伝子ツールの豊富さは、ゼブラフィッシュで開発されてきた。ゼブラフィッシュゲノムは、変異誘発および遺伝子導入3に従順である。現在までに、フォワードの過多および遺伝学的研究を逆に9,000を超える変異体3の生成につながる、行われている。さらに、数多くのトランスジェニック系統を持っていること作成し、その特定の細胞型3のラベリングおよび単離を可能にした専用。ゼブラフィッシュ国際リソースセンター(ZIRC)〜8ではなく、低コストで研究室のためにアクセス可能である研究コミュニティへのこれらのリソースを、一元化し、配布するための重要な継続的な努力がなされてきた。さらに、生体情報およびシーケンスおよびプロトコルをモルホリノする遺伝子発現パターンに至るまで分子ツールの広範なリポジトリは、漸進的にゼブラフィッシュ情報ネットワーク(ZFIN)9-11でアノテートされています。これらのゼブラフィッシュの研究インフラが重要なNIHのサポートと、この動物モデル8の擁護を通じて可能になってきた。ゼブラフィッシュ変異体、トランスジェニック系統、および関連情報のこのキャッシュは、大規模での生物学的な研究コミュニティへの例外的な価値があると続けている。ゼブラフィッシュは今、十分に確立し、卓越したモデル生物であるがしかし、それらはアラカルトを表す化学遺伝学的スクリーニングを使用して、発生生物学や病気を研究するrgely未開発の貯水池。
化学遺伝学は、生物系12内の生物学的プロセスに影響するような薬物または他の化合物などの小分子の使用である。化学遺伝学は、薬剤をその救助を特定したり、特定の遺伝的欠陥12を悪化させるような、遺伝子機能の分子機構を理解するために実装することができる。さらに、化学遺伝学は、トランスレーショナルリサーチ12を実施する一つの大きな道を表しています。動物モデルでの伝統的なフォワード遺伝子スクリーニングは疾患特異的遺伝子をリンクに途方もなく強力であったが、彼らはそれが困難またはできない場合が初期胚発生後に生じるであろう表現型を観察すること、時間次元を欠いている。さらに、遺伝子の冗長性は解釈が困難フォワード遺伝学から観察された結果を作ることができます。あるいは、化学遺伝学的スクリーニング微細な時間的制御を可能にし、同時に、創薬12,13のための有用な出発点を提供する。
化学遺伝学は、生物体全体として( 例えば、細胞株、タンパク質)は、インビトロ系を用いて 、またはin vivo系を用いて行うことができる。それは生物全体のシステムよりも単純であるため、化学遺伝学のためのin vitroの系を使用することは有益なことができ、大規模、低コスト、かつ少ない時間集約的で扱いやすい。その結果、in vitro系は、ハイスループットスクリーニング(HTS)およびハイコンテントスクリーニング(HCS)の両方を可能にする。化学遺伝学だけでなく、重大な限界に近づいたときに考慮されるべきであるin vitro系を使用する利点は多数ある。細胞株を使用する1つの主な制限は、小分子が特定の細胞系において有効かつ非毒性で、しかも生物全体に導入された場合に毒性になることができることである。このように、核心問題のin vitroでのシステムは生物の幅広い文脈を捕捉していないので、常に正確に生物全体で何が起こるかを模倣することができないということです。全生物中の化合物の試験は、これらの問題を回避できますが、哺乳動物の全生物モデルの使用は、物理的および倫理的な多くの制限をもたらす。例えば、マウスにおける薬物スクリーニングは、ロジスティック十分なサンプルサイズをテストするために必要なスペースや費用によって妨げられる。また、発達の質問は、哺乳動物は子宮内で発症するという事実のために、研究することは困難である。生物医学研究の行為は莫大な社会的価値を有している。最後に、強烈な研究を制限し、研究のために使用される動物の痛みや苦しみを緩和することにより、動物福祉を保護するための相当なニーズがあるにもかかわらず。ゼブラフィッシュは、哺乳類のような高等脊椎動物での作業に実行可能な代替を提供し、さらに、多くのトピックがで化学遺伝学を用いて研究することができます胚および幼虫期の神経学的処理は低レベル12,13で存在しないか、動作可能である。
化合物の送達が関心12-15の薬剤を含有する培地中で胚を浸漬することによって達成することができるように、現在までのところ、化学遺伝学的スクリーニング無数のは、特に、ゼブラフィッシュ胚を用いて行われてきた。さらに、16-20可能かつ管理化学遺伝学的スクリーニングを行うための多数の科学技術の進歩があった。ピーターソンらは、2000年に化学遺伝学的スクリーニングでゼブラフィッシュを使用した最初の、そして後に2004年にゼブラフィッシュ21,22における大動脈縮窄変異を抑制化合物を同定した。化学スクリーンは以来、いくつかの発展途上組織( 例えば 、心臓、血液、血管)23-25、生理的な機能( 例えば、行動のための神経学的根拠)26、大人の再生27,28、およびdiseasを研究するために実施されてきた Eモデル( 例えば、筋ジストロフィーおよび癌)29,30。これらのゼブラフィッシュの化学スクリーンの中から、プロスタグランジンは、造血幹細胞を制御する発見は「ベッドサイドにタンク」から動かす力を発揮、ヒトでの臨床試験に連れて行かれました23,31-33(NIH、臨床Trials.gov、NCT00890500。 NCT01627314)。これらは、臨床試験への移行には至っていないものの、最近では、有望な候補治療薬は、多発性嚢胞腎(PKD)34および急性腎傷害27,35における細胞病理を修復腎臓のような複雑な器官のために浮上している。これらの化学遺伝学的スクリーニングは、広く開発ゼブラフィッシュおよび成体組織の機能を調べるために、化学遺伝学を適用する能力の小さい化合物を試験の有用性を実証する。さらに、学術研究の19ために利用可能である市販の薬理学コレクションの成長のリストがあります。
ove_contentは">ここ数年では、自動化されたイメージング·システム36〜38とともに、薬物分注および取り扱いのためのロボットの自動化システムの使用を含む化学遺伝学的スクリーニング技術における顕著な進歩がなされている。このようなシステムは、の可能性を考慮残念ながら、これらの革新的なロボットの企業との化学遺伝学的スクリーニングの事業は一般的にかなりのリソースを必要とします。両方のHTSおよびHCS 36-38を達成するための化合物の多くは何千ものテスト。リソースのこれらのタイプは取得する資本を欠いている多くの機関にとって大きな障害であるプレートに配列するための胚の移植を含む化学ライブラリーのロボット処理のためのインフラを構築しながら、運用、およびそのような計装を維持します。、多くのラボで、自動化されたイメージングおよび分析のための法外なコストは一般的に、よりアクセス可能です残る12。自動化された画像スクリーニングは、定量化が可能になり蛍光トランスジェニックReのポーターおよび特定の表現型分析12,15を容易にします。自動化されたシステムは、便利な技術の進歩を表していますが、多くの質問は、このようなin situハイブリダイゼーション (WISH)読み出し39 でホールマウントと発達過程に数千の生物学的に活性な化合物のクエリとして、より焦点を絞ったマニュアルスクリーンによって対処することができる。ラボが増えて研究課題を調査するためにゼブラフィッシュの化学スクリーンを呼び出さてきたが、さらに、少数の(もしあれば)の努力が飽和状態に達していると多くのトピックは、化学遺伝学を使用して破られるには至っていない。化学画面は、わずか数は、野生型またはトランスジェニックタンクからなる小さなゼブラフィッシュのコロニーを使用して実行することができる。したがって、遺伝的尋問のこの形式は、この分野に多様化/拡大に興味が最もゼブラフィッシュの研究グループによって達成可能である必要があります。様々なサイズの化学ライブラリは、商用ディストリビューターおよび/またはCOLから調達することができますlaborators。これらの理由から、化学遺伝学は、過酷な資金気候で経済的に実現可能であることができる。しかし、このようなスクリーンの物流の側面を計画する方法などの化学遺伝学の画面を開始するハードルが、あります。 例えば、正常な画面のために必要な人員の数、専用の時間配分と一緒に物理的なプロトコルを縫い合わせ、サンプルを手動で処理する数千数百からその番号。ここでは、詳細マニュアルハイスループットプロトコルは、読み出しとしてWISHでゼブラフィッシュ胚における化学遺伝学を実行する。この方法は、mRNA転写物のリボプローブを検出したゼブラフィッシュ胚の薬物治療を伴う。このプロトコル、小規模なチーム、あるいは1個体を用いて合理的にすることができます画面と9週間のスパンで約600の化合物をささやかな化学ライブラリを分析。
ゼブラフィッシュにおける化学遺伝学は、創薬の進行に重大な影響を作ることができます。このプロトコルは、効果的に、小分子スクリーンを実施する個人または小規模なチームを可能にする、WISH読み出しとゼブラフィッシュ胚において、化学遺伝学を実行するために手動のハイスループット方法を提供する。この最小限の資源方法は、多くの研究グループが、化学遺伝学の可能性を拡張する。このようなシステムは広く研究部門全体ではアクセスできませんように具体的には、この画面戦略は、ロボット計装の使用に重要な代替手段を提供します。このマニュアルは画面には、6日間の作業週でWISHの読み出しを有する化合物の1の96ウェルプレートをテストするための単一の個人を可能にします。ゼブラフィッシュ以来、親の外に発生中の胚で、卵生であり、胚(1-3ミリメートル(mm))肉眼で見ることのに十分な大きさで、彼らは、単純な楽器との研究者缶アレイをサンプルと手作業のため適している顕微鏡を使用せずにマルチウェルプレート。ゼブラフィッシュは、急速に発展ので、小分子の曝露は、さらに手動の処理を最小限に抑える化合物の単回の治療ではなく、反復投与、と効果的である。彼らの卵黄が摂食稚魚の合併症を排除5-6日後に受精への栄養までのソースを提供するため、ゼブラフィッシュの胚は簡単に培養される。さらに、幼虫の臓器の大半を開発し、研究課題を幅広く研究する機会を提供し、この期間中に機能的になってきた。胚培養培地への小分子の単純加算は、非侵襲的であり、研究者(複数)は、薬物用量のための添加時期を選択することができ、かつ露光こうしての持続時間は、多くの変数を厳密に制御を提供し、特定の発達プロセスを可能にする興味の照会される。ここで説明したように、かなりの研究の生産性は、短いtimefrで達成することができるこのマニュアルのスクリーンの方法論を用いてAME。我々の経験では、そのような腎開発中ネフロンセグメンテーション(; PoureetezadiとWingert、未発表の図4)のように、興味のあるプロセスを分析することが知られた生物活性化合物ライブラリーを使用することにより強調することが可能に投資努力、高いリターンがあります。
それは、固定ゼブラフィッシュ標本上のアッセイが含まれるため、ここで説明マニュアルの化学画面は非常に汎用性があります。例えば、この戦略は一週間での化合物のいくつかのプレートをテストするために改訂することができますし、次の週の胚を獲得する。そのような免疫組織化学または他の組織染色の準備として、固定ゼブラフィッシュ試料上の代替のアッセイは、また、WISH読み出しの代わりに用いることができる。ゼブラフィッシュにおける細胞アッセイを行う実験的な戦略は、初期の発達段階の光学的透明性と透明性に適応可能である。さらに、研究者は後で駅で色素沈着を阻害することができるGESは、化学物質を使用するか、完全にキャスパーまたは薄手のゼブラフィッシュ13のような顔料レス遺伝回線を使用して、顔料の開発の複雑化を避ける。それは、プロセス、手動で小分子を投与することが関心のある汚れ(S)実現可能で、かつシンプルな実体顕微鏡を使用して胚を手動で採点する。しかし、自動画像解析を行うことができることを心に留めておくことが重要であり、実際には、高解像度表現型分析のために必要とされ得る。これは、サンプルの手動処理を合理化し、肉眼で容易に識別可能ではない違いを定量化し、研究者バイアス15を排除するように、例えば、それは、そのようなトランスジェニックレポーターとして相手の直接アッセイによる自動画像解析システムに好ましいかもしれない。幸いなことに、いくつかの自動化されたイメージング·システムは、ソフトウェアのコスト15の面でユーザーフレンドリーかつ経済的の両方である。他の自動化システムの使用や能力は急速に進化してできています薬物治療を管理し、オリエント生物に使用すること、さらには生物12,15を再配置する。これらの自動化システムは、研究の新しい技術の時代を予告しており、試験対象を大量に操作するので、HTSを実行するために革新的なソリューションを提供してきたし、HCSは全生物12,15に近づく。そのような機械は紛れもなく便利なツールですが、彼らはまた、非常に高価であり、多くの基本的な研究機関のための手の届かないところにある。これらの自動機能にアクセスすることなく、それが化学の画面が不可能であることに思えるかもしれません。しかしながら、このプロトコルは、合理的な期間にわたり実際的な方法では、化学遺伝学の画面を完了するために使用することができる手動スクリーンを実施する方法のためのガイドを概説する。
一般的に、手動のスクリーニングおよび化学遺伝学のための欠点が存在し、化学画面を検討する際に留意すべきである。具体的には、ここで実証した方法は、中等度が必要物理的な器用さの。器用さは練習で改善されるように、この懸念は、反復を通して減少または完全に回避される。分析のためのウェルあたりわずか10の胚がある限りまた、グロスエラーのための最小限の余地がある。小分子が誘導されるので、興味のある化合物を同定するための合理的なスコアリングレジメンに接着しなければならない表現型の浸透率を変えることができる。それは、このプロトコルを利用して、研究者は、彼らがヒットを検討します何のために適切に厳格な基準を考案することが重要です。これは、画面のこの形式の性質は最も可能性の高いさらなる化学ワークアップを通して描写することができます偽陽性の特定の部分を、得られますことを心に留めておくことも重要です。また、正確に胚をステージングすると、非同期開発正確薬物治療の効果を評価する合併症を引き起こすことができるので、すぐに受精後のスクリーニングのためのクラッチを収集することが重要である。さらに、元のような化学的スクリーニングに関してでperimental戦略、制限事項のホストがあります。担体分子( 例えば、ジメチルスルホキシド(DMSO))の化合物の溶解性および毒性はまた、問題を提示することができ、多くの分子を試験する際に法外であってもよい。絨毛膜は、薬物曝露に対するバリアとして作用することができる。最後に、ゼブラフィッシュは、化学遺伝学のための強力なおよび翻訳モデルであっても、介護は常にそのような細胞株として、in vitro系を用いて、例えば 、代替の化学スクリーン戦略かどうかを決定する際に注意が必要、全体の使用の代わりに用いることができる動物。それは化合物の全身効果を収集するという利点を提供し、哺乳動物モデルにおいて試験する化合物のリストをトリアージするために研究者を可能にすることができるようにもかかわらず、全体のゼブラフィッシュ系における化学的処理は、哺乳動物における同様のアプローチを実施するに好ましいと考えられる。
現在までに、ゼブラフィッシュの化学スクリーンは強力な実験ツールtを提供しているO開発のメカニズムを描写し、そのような疾患の病態を防止することができる分子の同定としては、医療で用いるための候補薬理学的薬剤を確認する。例えば、バーンズらによる研究では、心筋42内にGFPを発現するトランスジェニックゼブラフィッシュ胚を用いて、心拍数のための自動化されたマイクロウェルアッセイを開発しました。これらは、開発中の心拍数を分析するために、このトランスジェニック系統を使用し、それは薬物治療42上にどのように影響を受けた。別の研究では、ゼブラフィッシュ胚での造血幹細胞の集団密度を試験することによって、プロスタグランジンE2は、HSCニッチ23を調節することを同定した。この知見は、マウスで検証し、後にヒト臍帯移植23,31-33(NIH、臨床Trials.gov、NCT00890500、NCT01627314)での臨床試験のために実装されました。いくつかの最近の研究により、化学遺伝学は、ゼブラフィッシュを用いて、腎疾患を研究するのに有用であることが証明されている<s> 43アップ。ゼブラフィッシュ腎臓はネフロンの腎形成または再生を研究するための優れたパラダイム、開発および急性腎臓損傷43の間に腎臓を含み、機能ユニットを提供する。ネフロン構造は非常にゼブラフィッシュ胚性腎臓および成人の哺乳類の腎臓44-50の間で保存されている。化学遺伝学と組み合わせるとゼブラフィッシュ胚性腎臓を調べるいくつかの研究が明らかに本来の翻訳の可能性を示している。化学遺伝学画面が多発性嚢胞腎(PKD)34キープレーヤーであることが知られている遺伝子PKD2およびift172にマッピングされた2つのゼブラフィッシュ変異体で実施した。画面には、通常、変異胚において見られる形態学的欠陥を無効にすることができる小分子のようなトリコスタチンA(TSA)阻害剤、汎ヒストンデアセチラーゼ(HDAC)を同定をもたらした。デGrohと同僚が撮影した別のアプローチがinduc化合物についてスクリーニング腎機能35の中断を示すことになる野生型ゼブラフィッシュ胚におけるED浮腫。ヒットとしてPTBAを識別した後、それらは浮腫を引き起こすことに加えて、PTBAはまた、腎前駆細胞のマーカーをpax2aの発現の増加が観察された。重要なことに、PTBAの最適化された誘導体は、その後、ゲンタマイシン誘発性腎臓損傷を受け、さらに、腎障害27を患ったマウスの回復を加速成体ゼブラフィッシュのパーセントの死亡を減少させることが示された。まとめると、ゼブラフィッシュの化学遺伝学のこれらの寄与は、このプロトコルに記載された方法を用いて作製することができる発見のタイプを披露。
化学遺伝学研究は、実質的なメリットを担うが、それは特定の課題がないわけではない。単にそれが化合物によって影響を受けている特定の遺伝子または遺伝子を決定するために複雑にすることができ、化学遺伝学アプローチを用いて。ターゲットは、(複数の)発見された場合であっても、シgnificantギャップは、化合物の同定および小分子がどのように動作する作用機序(複数可)を理解する間に残ることができる。単一の化合物が、生物内の異なる効果の範囲を有することが可能であるため、例えば、小分子が作用する機構を決定することは困難である。しかし、新技術の出現や複数の化学遺伝学的スクリーニングはゼブラフィッシュに完成した状態で、メカニズムを決定する問題は縮小している。同定された化合物の分子の効果を判断するための一つの方法は、機構は、潜在的に、以前の注釈付きのデータから推定することができるスクリーニングのための既知の生物活性物質の薬物ライブラリを選択することである。また、ディスカバリーゲートのようなchemoinformaticアルゴリズムは、生得的なメカニズム14を有する化合物のデータベースに対する化合物の構造的類似性を比較することができます使用するために用意されています。化合物のメカニズムを解明するためのさらに別の方法は、MICRを生成することであろうその後oarray治療後のプロファイルや、接続マップなどのマイクロアレイ薬物プロファイルのコンパイルでこのプロファイルを照会、同様の効果を引き出す14の機構的に定義される化合物を探索する。このアプローチは、目的の化合物と同様の効果を有する遺伝子変異体を同定するために用いることができる。化合物および変異体との間の接続を見つけることは化合物が化合物およびモルフォリノで突然変異体を処理することによって線引きすることができ、関連する遺伝子の分子的に上流または下流に動作することを提案するかもしれない。別のオプションは、ゼブラフィッシュのためのより最適化になることを継続している質量分析、だろう。この方法は、薬物治療後の特定のタンパク質の変化または翻訳後修飾を描写するために使用することができる。最後に、小分子あるいはライブラリ全体は時々結合パートナーのプルダウンのためにタグ付けされることが可能である。それは、また、注目に値することながら、どのように小分子の機能のメカニズムのi重要な輸入のsが、メカニズムは不明のままであるためにFDA承認薬があります。
ゼブラフィッシュは、両方の遺伝的および生理的に哺乳動物に多くの類似性を示すものの、依然として薬物クロスオーバー14の問題があります。ある研究では、ゼブラフィッシュ胚50における細胞周期阻害剤のスクリーニングからのヒットのクロスオーバー能力を調べた。画面には、細胞周期活性を有することが以前に未知であった14のヒットが同定された。 6は、ヒトおよびゼブラフィッシュ細胞培養アッセイの両方において細胞周期活性を有することが見出された、3は細胞培養アッセイにおいて不活化血清であることが示されたこれらの14の化合物のうち、1はゼブラフィッシュ細胞において活性であり、4のいずれかにおいて活性を有さなかったゼブラフィッシュまたはヒト細胞培養アッセイが、唯一のゼブラフィッシュ生物全体で。注目すべきことに、唯一のゼブラフィッシュで活性を有した4化合物がprohiもゼブラフィッシュと哺乳類の間に違いがあることを実証している特定の化合物の並進潜在的なビット。しかし、これは、哺乳動物における腎回復速度を向上させるヒトレシピエントとPTBA誘導体で生着するHSCの能力を増幅するPGE 2、従って証拠を提供するような小分子の例は、存在に留意することが重要な考慮事項であるクロスオーバー23,31-33可能であるという原則。
かかわらず、これらの落とし穴、化学遺伝学とこの最小資源アプローチの研究コミュニティを提供するために多くあります。化学遺伝学は、ゼブラフィッシュで特に有用であり、分子経路の尋問や創薬に重要な役割を果たしていきます。離散分子標的に基づく化学画面は歴史的に起因する吸着、分布、代謝、排泄、および毒性(ADMET)の特性51の星座として知られているものに、高い故障率の対象となっている。にゼブラフィッシュを用いた化学スクリーンむしろ離散目標より、プロセスに焦点を当て、いくつかのADMETの問題を回避し、生物全体のコンテキストで有効である化合物を同定することができます。現在の変異株とターゲットを絞った遺伝的変異体およびトランスジェニックを作成するために、ゲノム編集を使用する機能など、ゼブラフィッシュ研究のための利用可能なリソースの増加プール、と、ゼブラフィッシュを用いて、潜在的な化学遺伝学的スクリーニングの無限の数は事実上存在します。多くの化学ライブラリは、キュレーション、および既知の生物活性物質、構造的に多様かつ構造的に類似した新規化合物、とのスパンのコレクションされています。これらの試薬は、現在入手可能であり、さらに今後数年間で成長する可能性があるスクリーンの組み合わせのためのエキサイティングな機会を豊富に提供しています。手にこれらの可能性では、このマニュアルとハイスループットプロトコルは、ゼブラフィッシュを用いた化学遺伝学的スクリーニングに着手する研究グループの能力を向上するための実用的かつユーザーフレンドリーな方法を提供します。
The authors have nothing to disclose.
この作業は、次の中からWingertの研究室への資金によってサポートされていました:国立衛生研究所は、K01 DK083512、DP2 OD008470、およびR01 DK100237を付与。ダイムバジルオコナースターター奨学生助成賞#5-FY12-75の行進。科学と生物科学科のノートルダム大学の大学から資金を起動する。そしてギャラガー家族に代わってエリザベスとマイケル·ギャラガーからノートルダム大学に寛大な贈り物は、幹細胞研究育成する。資金提供者は、研究デザイン、データ収集と分析、公開することを決定、または原稿の準備に何の役割を持っていなかった。私たちは、原稿上の重要なフィードバックを提供するためのポール·T.クルーガー、ジュニアに感謝します。我々は彼らのサポートのために生物科学科のスタッフに感謝し、私たちのゼブラフィッシュコロニーのケアと福祉におけるその優れた献身のためのノートルダムでのゼブラフィッシュ研究センター。最後に、我々は我々のresearのメンバーに感謝この作品についての彼らのコメント、議論や洞察力のためのCHラボ。
JoVE 51922 MATERIALS | |||
Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
0.1 – 10 υL natural pipet tips | USA Scientific | 1111-3800 | |
1 X E3 | N/A | N/A | Generate using 50X E3 and DI water. |
1 X Pbst | N/A | N/A | Generate 0.1% Tween-20 in 1 X Pbs. |
10X Pbs | American Bioanalytical | AB11072 | |
12-well staining dish | BD-Falcon | 35-3225 | |
20X SSC | American Bioanalytical | AB13156 | |
24 well plate | BD-Falcon | 35-3226 | |
4% PFA/1X Pbs | N/A | N/A | Generate 4% PFA (w/v) in 1 X Pbs – boil then freeze and store at -20 °C. |
48 well plate | CytoOne | CC7672-7548 | |
50 X E3 | N/A | N/A | Generate 16.5 mM CaCl2, 16.5 mM MgSO4, 250mM NaCl, and 8.5mM KCl in DI water. |
96 deep well plate | VWR | 100-11-940 | |
96 well plate sealing mat | VWR | 10011-946 | |
anti-digoxigenin antibody | Roche | 11-093-274-910 | Keep at -20 °C. |
anti-fluorescein antibody | Roche | 11-426-338-910 | Keep at -20 °C. |
BCIP stock | Sigma | B8503 | Generate 50 mg/mL using 100% DMF – freeze then store at -20 °C. |
block solution | N/A | N/A | Generate 50 mL using 10 mL BSA (10%), 5 mL FCS, and 35 mL MABT. (Thaw BSA and FCS at 37 °C.) |
BSA (bovine serum albumin) stock | American Bioanalytical | AB00448 | Generate 10% BSA by stirring BSA flakes in MAB at room temperature then freeze and store at -20 °C. (Keep unused BSA flakes at 4 °C.) |
DIG/FLU labeled riboprobe in vitro transcription reaction reagents | Roche | 11175025910; 11685619910 | Consult the manufacturer procedure. |
DMF (dimethylformaldehyde) | American Bioanalytical | AB00450 | |
DNase 1 inhibitor, 10 X DNase 1buffer | Roche | 4716728001 | |
embryo incubation dish | Falcon | 35-1005 | |
epT.I.P.S 20-300 υL | Eppendorf | 22492284 | |
Ethanol (EtOH) | Sigma | E7023 | Generate 50mL of 70% EtOH with molecular grade H2O and 100% EtOH then store at -20 °C. |
FCS (fetal calf serum) stock | Invitrogen | 16140089 | Keep at -20 °C. |
filter sterilization unit | Corning | 430516 | 0.45 υm CA / 1L volume |
fine forceps | Roboz | RS-1050 | |
flat-bottom microcentrifuge tube | VWR | 87003-300; 87003-298 | |
Formamide | American Bioanalytical | AB00600 | Keep at -20 °C. |
glass basin 90 x 50 | Kimax Kimble | 23000 | |
glass pipette | VWR | 14673-010 | |
glass vial | Wheaton | 225012 | |
glycerol | Sigma | G7893 | |
glycine | Sigma | G8898 | |
glycogen | Roche | 10901393001 | |
HYB+ | Generate 50% formamide, 0.1% Tween-20, 5X SSC, 5 mg/mL yeast torula RNA, and 50 υL/υL heparin | ||
INT stock | Sigma | I8377 | Generate 55mg/mL using 70% DMF and 30% H2O – freeze then store at -20 °C. |
MAB | Generate by adding 55.0 g Trisma base, 8 mL of 1M Tric-HCl pH 9.5, 23.2 g maleic acid, and 17.5 g NaCl to 1.5 L of deionized H2O. Then fill with deionized H2O to 2L and autoclave. | ||
MABT | N/A | N/A | Generate 0.1% Tween-20 in MAB |
MeOH | Sigma | 34860-4L | |
mesh tea strainer | English Tea Store | SKU #ASTR_KEN, MPN#1705 | |
molecular grade distilled water | Mediatech | 25-055-CM | |
multi 8-channel pipette 0.5 – 10 υL | Eppendorf | 3122000.019 | |
multi 8-channel pipette 30 – 300 υL | Eppendorf | 3122000.051 | |
nanodrop | Thermo | ND-2000c | |
NBT stock | Sigma | N6876 | Generate 50mg/mL using 70% DMF and 20% H2O – freeze then store at -20 °C. |
paraformaldehyde | Electron Microscopy Services | 19210 | |
PCR-Film adhesive | Eppendorf | 30127.48 | |
plate container (Pencil Box) | Sterilite | 1722 | |
pre-staining buffer | N/A | N/A | Generate 01% Tween-20, 50 mM MgCl2, 100 mM NaCl, and 100 mM Tris pH 9.5. (Make fresh for use each time.) |
Pronase | Roche | 11459643001 | Generate 50mg/mL using E3, freeze then store at -20 °C. |
Proteinase K | Roche | 03-115-879-001 | Generate 10mg/mL in DI water then freeze and store at -20 °C. |
RNase 1 inhibitor | Roche | 3335399001 | |
rubber bulb | Fisherbrand Fisher Scientific | 03-448-22 | |
small plastic Petri dish | Corning | 430589, 430588 | |
SP6 RNA polymerase | Roche | 11487671001 | |
staining solution-purple | N/A | N/A | Generate using 45 υL of NBT and 35 υL of BCIP for every 10 mL needed in pre-staining buffer. |
staining solution-red | N/A | N/A | Generate using 31.5 υL of INT and 35 υL of BCIP for every 10 mL needed in pre-staining buffer. |
stereomicroscope | Nikon | SMZ645, SMZ1000 | |
T3 RNA polymerase | Roche | 11031171001 | |
T7 RNA polymerase | Roche | 10881775001 | |
transfer pipet | Samco | 202, 204 | |
Tween-20 stock | American Bioanalytical | AB02038 | |
waterbath | Thermo | 51221073 | (Model # 2831) |