El pez cebra es un organismo experimental excelente para estudiar los procesos de desarrollo de vertebrados y la enfermedad humana modelo. A continuación, describimos un protocolo sobre cómo realizar una pantalla manual de alto rendimiento químico en embriones de pez cebra con todo el montaje hibridación in situ (ojalá) de lectura.
El pez cebra se han convertido en un organismo modelo ampliamente utilizado para investigar los mecanismos que subyacen a la biología del desarrollo y para estudiar la patología de la enfermedad humana debido a su considerable grado de conservación genética con los humanos. Genética químicos implica probar el efecto de que las pequeñas moléculas tienen en un proceso biológico y se está convirtiendo en un método popular de la investigación traslacional para identificar compuestos terapéuticos. El pez cebra son atractivos específicamente a utilizar para la genética química debido a su capacidad para producir grandes garras de embriones transparentes, que son fertilizados externamente. Además, embriones de pez cebra pueden ser fácilmente tratado con fármaco por la simple adición de un compuesto a los medios embrión. El uso de todo el montaje hibridación in situ (DESEOS), la expresión del ARNm puede ser claramente visualizado en embriones de pez cebra. Juntos, el uso de la genética química y desea, el pez cebra se convierte en un contexto de todo el organismo potente en el que para determinar el celular y fisiológicoefectos de moléculas pequeñas. Innovadores avances se han hecho en las tecnologías que utilizan procedimientos de detección basados en máquinas, sin embargo, para muchos laboratorios dichas opciones no son accesibles o que permanecen costo prohibitivo. El protocolo descrito aquí se explica cómo ejecutar una pantalla genética manual de química de alto rendimiento que requiere recursos básicos y se puede lograr por un solo equipo individual o en pequeños en un período de tiempo eficaz. Por lo tanto, este protocolo proporciona una estrategia viable que puede ser implementado por grupos de investigación para llevar a cabo la genética química en el pez cebra, que puede ser útil para obtener conocimientos fundamentales en los procesos de desarrollo, mecanismos de la enfermedad, y para identificar nuevos compuestos y vías de señalización que tienen aplicaciones médicamente relevantes .
La identificación de los fármacos terapéuticos eficaces para el tratamiento de enfermedades humanas es el final del juego para muchos investigadores biomédicos. Si bien la identificación y caracterización de agentes farmacológicos potenciales para aplicaciones clínicas tiene un valor evidente para la salud, ha seguido siendo un reto importante. En última instancia, el desarrollo de muchos compuestos terapéuticos proviene del conocimiento de cómo tipos de células específicos o bien desarrollan o función. El pez cebra, Danio rerio, es un teleósteo de agua dulce de la familia de los ciprínidos que se ha convertido en un organismo modelo dominante en la biología del desarrollo 1. El pez cebra son tratables genéticamente vertebrados que son fáciles de mantener y manipular para los estudios científicos 2,3. El embrión de pez cebra es transparente, fertilizado externamente, y puede ser producido por los cientos de un solo par de acoplamiento adulto en sólo una semana 2,3. Por otra parte, los principales sistemas y órganos comparten pez cebra poseen un gran degree de similitud genética con los mamíferos, incluyendo seres humanos 4. Sorprendentemente, el 70% de los genes humanos tienen un ortólogo de pez cebra 4. Debido a esta similitud, el pez cebra haber sido un sistema experimental muy relevante para el estudio de los mecanismos de desarrollo de los vertebrados y de la fisiología, y se han empleado para recapitular una multitud de enfermedades humanas 5-7. Estas razones, entre otras, han hecho que el pez cebra un candidato ideal para continuar interrogatorios genéticos y ha dado lugar a un reconocimiento cada vez mayor para la utilidad de pez cebra en la investigación biomédica 6,7.
Durante las últimas décadas, una gran cantidad de herramientas genéticas se han desarrollado en el pez cebra. El genoma pez cebra es susceptible de mutagénesis y la transgénesis 3. Hasta la fecha, se han realizado una gran cantidad de avance y retroceso estudios genéticos, lo que lleva a la generación de más de 9.000 mutantes 3. Por otra parte, numerosas líneas transgénicas tienen seres creado, que han permitido el etiquetado y el aislamiento de los tipos de células específicas 3. Se han realizado esfuerzos continuos para centralizar y distribuir estos recursos a la comunidad de investigación, que son accesibles para los laboratorios en un lugar bajo costo a través del Centro Internacional de Recursos de pez cebra (ZIRC) 8. Además, un amplio repositorio de información biológica y herramientas moleculares, que van desde los patrones de expresión de genes de morfolino secuencias y protocolos, se han anotado progresivamente en la Red de Información de pez cebra (ZFIN) 9-11. Se han hecho posible estas infraestructuras de investigación de pez cebra a través de un apoyo significativo de los NIH y la defensa de este modelo animal 8. Esta caché de mutantes de pez cebra, las líneas transgénicas, y la información pertinente sigue siendo de un valor excepcional a la comunidad de investigación biológica en general. Sin embargo, mientras que el pez cebra son ahora un organismo modelo bien establecido y preeminente, que representan a largely yacimiento sin explotar para el estudio de la biología del desarrollo y la enfermedad mediante el uso de pantallas genéticos químicos.
La genética química es el uso de pequeñas moléculas, tales como fármacos u otros compuestos, para afectar a un proceso biológico dentro de un sistema vivo 12. Genética química pueden ser implementadas para comprender los mecanismos moleculares de la función de genes, tales como para identificar agentes que rescate o exacerbar un defecto genético específico 12. Además, la genética química representa una vía importante para llevar a cabo la investigación traslacional 12. Mientras que las pantallas adelante genéticos tradicionales en modelos animales han sido tremendamente poderosa en la vinculación de los genes específicos para las enfermedades, carecen de una dimensión temporal, por lo que es difícil oa veces imposible observar fenotipos que surgirían después de la embriogénesis temprana. Además, la redundancia de genes puede hacer que los resultados observados desde la genética a plazo difíciles de interpretar. Alternativamente, pantallas genéticos químicospermitir el control temporal fina y proporcionar al mismo tiempo un valioso punto de partida para el descubrimiento de fármacos 12,13.
Genética química se puede realizar utilizando sistemas in vitro (por ejemplo, líneas celulares, proteínas) o usando un sistema in vivo, tal como un organismo completo. Utilizando un sistema in vitro para la genética química puede ser beneficioso, ya que es más sencillo que un sistema de organismo completo, más fácil trabajar con a gran escala, menos costoso, y que consuma menos tiempo. Como resultado, los sistemas in vitro permiten tanto para cribado de alto rendimiento (HTS) y cribado de alto contenido (HCS). Hay un número de ventajas de utilizar un sistema in vitro que se debe considerar cuando se aproxime a la genética química, pero también limitaciones significativas. Una limitación importante para el uso de una línea celular es que las pequeñas moléculas pueden ser eficaces y no tóxicos en una línea celular específica, sin embargo, llegar a ser tóxicos cuando se introduce en un organismo completo. Por lo tanto, el quidde la cuestión es que los sistemas in vitro no reflejan el amplio contexto de un organismo y, por tanto, no siempre son capaces de imitar con exactitud lo que ocurre en un organismo completo. Mientras que las pruebas de compuesto en organismos enteros puede eludir estas cuestiones, el uso de modelos de todo el organismo de mamíferos plantea una serie de limitaciones físicas y éticas. Por ejemplo, la detección de drogas en el ratón es logísticamente obstaculizada por el espacio y los gastos necesarios para probar un tamaño de muestra adecuado. Además, las cuestiones de desarrollo pueden ser difíciles de estudiar, debido al hecho de que los mamíferos se desarrollan en el útero. Por último, mientras que la realización de la investigación biomédica tiene un inmenso valor para la sociedad, no obstante, son necesidades importantes para proteger el bienestar animal mediante la limitación de intensos estudios y aliviar el dolor y el sufrimiento de los animales utilizados para la investigación. El pez cebra proporcionar un sustituto viable para el trabajo con los vertebrados superiores, como los mamíferos, y además, muchos temas se puede estudiar utilizando la genética química enlas etapas embrionarias y larvarias cuando el procesamiento neurológico está ausente u operativa a un bajo nivel de 12,13.
Hasta la fecha, una gran variedad de pantallas genéticos químicos se han realizado utilizando embriones de pez cebra en particular, como la entrega compuesto puede llevarse a cabo mediante la inmersión de los embriones en medios que contienen el fármaco de interés 12-15. Además, se han producido numerosos avances científicos y tecnológicos para hacer pantallas genéticos químicas posible y manejable 16-20. Peterson y sus colegas fueron los primeros en utilizar el pez cebra en una pantalla genética química en 2000, y más tarde en 2004 identificaron un compuesto que suprime una mutación coartación aórtica en el pez cebra 21,22. Pantallas químicos ya se han aplicado para estudiar varios tejidos en desarrollo (por ejemplo, el corazón, los vasos sanguíneos, 23-25), las funciones fisiológicas (por ejemplo, bases neurológicas del comportamiento) 26, la regeneración de adultos 27,28, y diseas modelos e (por ejemplo, distrofia muscular y cáncer) 29,30. De entre estas pantallas químicas de pez cebra, el descubrimiento de que las prostaglandinas regulan las células madre hematopoyéticas se ha tomado a los ensayos clínicos en seres humanos, lo que demuestra el poder de pasar de "tanque de cabecera" 23,31-33 (NIH, Trials.gov Clínica, NCT00890500; NCT01627314). Más recientemente, con la promesa terapéutica candidatos han surgido de órganos complejos como el riñón, que remedien la patología celular en la enfermedad renal poliquística (PKD) 34 y la lesión renal aguda 27,35, aunque sin embargo, estos tienen que pasar a los ensayos clínicos. Estas pantallas genéticos químicos ampliamente demuestran la utilidad de la prueba pequeños compuestos en el pez cebra en desarrollo y la capacidad de aplicar la genética química para interrogar a la función del tejido adulto. Por otra parte, hay una creciente lista de colecciones de farmacología disponibles en el mercado que están disponibles para estudios académicos 19.
ove_content "> En los últimos años, se han producido avances importantes en la tecnología de detección genética química, incluido el uso de sistemas automatizados de robots para la dispensación de medicamentos y manejo, junto con sistemas de imágenes automatizados 36-38. Estos sistemas permiten la posibilidad de probar muchos miles de compuestos para lograr ambos HTS y HCS 36-38. Por desgracia, la empresa de pantallas genéticos químicos con estas empresas robóticas innovadoras suelen requerir recursos considerables. Estos tipos de recursos son un impedimento significativo para muchas instituciones que carecen de capital para adquirir establecer, operar y mantener dicha instrumentación. Si bien el establecimiento de la infraestructura para el manejo robótico de bibliotecas químicas, incluyendo la transferencia de embriones a ataviado placas, sigue siendo un costo prohibitivo para muchos laboratorios, imagenología automatizada y el análisis es en general más accesible 12. proyección de imagen automatizada permite la cuantificación fluorescente de re transgénicoporteros y facilita el análisis fenotípico específico 12,15.Aunque los sistemas automatizados representan avances tecnológicos útiles, muchas preguntas pueden ser abordadas por las pantallas manuales más específicos, tales como la consulta de varios miles de compuestos biológicamente activos en un proceso de desarrollo con todo el montaje hibridación in situ (DESEOS) lectura de 39. Además, mientras que un número creciente de laboratorios han invocado pantallas químicas de pez cebra para investigar una pregunta de investigación, algunos de saturación (en su caso) los esfuerzos se han alcanzado y muchos temas aún no se han violado mediante la genética química. Pantallas químicos pueden ser ejecutadas usando una pequeña colonia de pez cebra que consta de sólo un tipo salvaje pocos o tanques de transgénicos. Por lo tanto, esta forma de interrogatorio genética debe ser alcanzable por la mayoría de los grupos de investigación de pez cebra interesados en ampliar / diversificación en este campo. Bibliotecas químicas de diferentes tamaños pueden ser adquiridos a partir de un distribuidor comercial y / o colcola-. Por estas razones, la genética química pueden ser económicamente factible incluso en climas duros de financiación. Sin embargo, existen obstáculos a partir de una pantalla genética químicos, tales como la forma de planificar los aspectos logísticos de la pantalla: por ejemplo, el número de personal necesario para una pantalla con éxito, la asignación del tiempo dedicado y armar un protocolo físico a muestras de proceso manualmente que el número de los cientos a varios miles. Aquí, detallamos un protocolo de alto rendimiento manual para ejecutar una genética química en el embrión de pez cebra con el deseo como una lectura. Este método implica el tratamiento farmacológico de embriones de pez cebra, seguido por la detección de transcritos de ARNm ribosonda. El uso de este protocolo, un equipo pequeño o incluso un individuo puede defender razonablemente y analizar una biblioteca química modesta aproximadamente 600 compuestos en el lapso de 9 semanas.
Genética química en el pez cebra puede hacer un impacto crítico en la progresión de descubrimiento de fármacos. Este protocolo proporciona un método de alto rendimiento para llevar a cabo manual de genética química en embriones de pez cebra con un deseo de lectura, lo que permite de manera efectiva un equipo individual o en pequeños para llevar a cabo una pequeña pantalla molécula. Este método de mínimo de recursos se extiende la viabilidad de la genética química a muchos grupos de investigación. En concreto, esta estrategia pantalla ofrece una importante alternativa al uso de instrumentación robótica, ya que tales sistemas no son ampliamente accesibles a través de los departamentos de investigación. Esta pantalla permite el manual de un solo individuo para poner a prueba una placa de 96 pocillos de compuestos con una lectura de WISH en una semana laboral de 6 días. Desde el pez cebra son ovíparos, con los embriones en desarrollo fuera de la matriz, y los embriones son lo suficientemente grandes como para ver con el ojo desnudo (entre 1-3 mm), son susceptibles de manipulación manual con instrumentos sencillos y el investigador puede muestras de matriz enplacas de múltiples pocillos sin el uso de un microscopio. Además, puesto que el pez cebra se desarrollan rápidamente, pequeña molécula de la exposición puede ser eficaz con un solo tratamiento de un compuesto, en lugar de dosis repetidas, lo que minimiza su posterior procesamiento manual. Embriones de pez cebra son fácilmente cultivadas porque su yema proporciona una fuente de nutrición hasta 5-6 días después de la fertilización, lo que elimina la complicación de alevines de alimentación. Además, la mayoría de los órganos de larvas han desarrollado y convertirse funcional durante este período, que ofrece la oportunidad de estudiar una amplia gama de preguntas de investigación. La simple adición de pequeñas moléculas a los medios de incubación de embriones es no invasivo y permite al investigador (s) para seleccionar la dosis del fármaco, el tiempo de adición, y la duración de la exposición de este modo proporcionar un estrecho control sobre muchas variables y permitir a los procesos de desarrollo específicas de interés para ser consultado. Tal como se describe aquí, productividad de la investigación significativa se puede lograr en un corto timefrAME el uso de esta metodología pantalla manual. En nuestra experiencia, hay un alto retorno sobre el esfuerzo invertido, que puede ser acentuado por el uso de una biblioteca química bioactivo conocido para analizar un proceso de interés, tales como la segmentación de nefronas durante el desarrollo renal (Figura 4; Poureetezadi y Wingert, sin publicar).
La pantalla químico manual descrito aquí es excepcionalmente versátil porque se trata de un ensayo en muestras de pez cebra fijos. Por ejemplo, esta estrategia puede ser revisado para probar varios platos de compuestos en una semana y luego anotar los embriones a la semana siguiente. Ensayos alternativos en muestras de pez cebra fijos, tales como los preparativos de inmunohistoquímica u otra tinción de tejidos, también podrían ser sustituidos por el deseo de lectura. Estrategias experimentales para llevar a cabo ensayos celulares en el pez cebra son adaptables debido a la claridad óptica y la transparencia de las etapas tempranas del desarrollo. Además, los investigadores pueden inhibir la pigmentación en sta tardeGES uso de productos químicos o evitar la complicación de desarrollo pigmento por completo mediante el uso de líneas genéticas en pigmentos como Casper o menos pura de pez cebra 13. Es factible administrar manualmente pequeñas moléculas, procesar la mancha (s) de interés, y anotar manualmente embriones utilizando un sencillo microscopio estereoscópico. Sin embargo, es importante tener en cuenta que el análisis automatizado de imágenes se podría realizar, y de hecho puede ser necesaria para el análisis de fenotipo de alta resolución. Por ejemplo, puede ser preferible para asociarse un sistema de análisis de imágenes automatizado con un ensayo directo, tal como un reportero transgénicos, ya que esto simplifica el procesamiento manual de las muestras, cuantifica las diferencias no son fácilmente discernibles a simple vista, y elimina el sesgo de investigador 15. Afortunadamente, algunos sistemas de imágenes automatizados son a la vez fácil de usar y económico en términos de costos de software 15. El uso y la capacidad de otros sistemas automatizados han evolucionado rápidamente y puedeser utilizado para los organismos orientar, administrar tratamientos con fármacos, e incluso de trasladar organismos 12,15. Estos sistemas automatizados han anunciado una nueva era tecnológica de la investigación y han aportado soluciones innovadoras para manipular grandes cantidades de sujetos de prueba y por lo tanto realizar HTS y HCS enfoques en organismos enteros 12,15. Si bien este tipo de máquinas son innegablemente útiles herramientas, que también son muy costosas y están fuera del alcance de muchos laboratorios de investigación básica. Sin acceso a estas capacidades automatizadas puede parecer que las pantallas de químicos no son posibles. Sin embargo, este protocolo describe una guía para cómo llevar a cabo una pantalla manual que se puede utilizar para completar una pantalla de la genética química de una manera práctica en un período de tiempo razonable.
Existen desventajas para ambos y químicas de detección genética manuales en general, y deben tenerse en cuenta al considerar una pantalla de química. En particular, el método ha demostrado aquí requiere un grado moderadode destreza física. Esta preocupación es disminuida o totalmente obviado través de la repetición, como la destreza mejorará con la práctica. Además, hay espacio para el error mínimo bruto, ya que sólo hay 10 embriones por pocillo para el análisis. Las moléculas pequeñas pueden variar en la penetrancia del fenotipo que es inducida, por lo que un régimen de puntuación razonable para identificar compuestos de interés se deben mantener. Es vital que los investigadores que utilizan este protocolo idear criterios rigurosos y adecuados para lo que van a considerar un éxito. También es importante tener en cuenta que la naturaleza de esta forma de la pantalla lo más probable es producir una cierta porción de falsos positivos, que pueden ser delimitados mediante una mayor química trabajo-up. Además, es crítico a la etapa embriones con precisión y para recoger los embragues para el cribado poco después de la fertilización, como desarrollo asincrónico puede conducir a complicaciones en evaluar con precisión el efecto de los tratamientos farmacológicos. Además, en lo que respecta a la detección química como un exestrategia experimental, hay una serie de limitaciones. La solubilidad del compuesto y la toxicidad de moléculas portadoras (por ejemplo, sulfóxido de dimetilo (DMSO)) pueden también presentan un problema y pueden ser prohibitivos en la prueba de muchas moléculas. El corion también puede actuar como barrera a la exposición al fármaco. Por último, a pesar de que el pez cebra son un modelo de gran alcance y de la traducción de la genética química, se debe siempre tenerse en determinar si una estrategia alternativa pantalla química, por ejemplo, usando un sistema in vitro como una línea celular, puede ser sustituido por el uso de todo animales. Sin embargo, el tratamiento químico en todo el sistema de pez cebra se considera preferible llevar a cabo enfoques similares en mamíferos, ya que proporciona la ventaja de reunir los efectos sistémicos de los compuestos y puede permitir a los investigadores para clasificar la lista de compuestos a ensayar en un modelo de mamífero.
Hasta la fecha, las pantallas químicos pez cebra han proporcionado una poderosa herramienta experimental to delinear los mecanismos de desarrollo y para determinar agentes farmacológicos candidatos para uso en medicina, tales como la identificación de moléculas capaces de prevenir patologías de la enfermedad. Por ejemplo, un estudio realizado por Burns y colegas desarrollaron un ensayo automatizado micro-bien para ritmo cardíaco usando embriones de pez cebra transgénicos que expresaban GFP en el miocardio 42. Utilizaron esta línea transgénica para analizar la frecuencia cardíaca en el desarrollo y la forma en que se vio afectada en el tratamiento de drogas 42. Otro estudio, probando la densidad de la población de células madre hematopoyéticas en el embrión de pez cebra, identificó que la prostaglandina E2 regula el nicho de HSC 23. Este hallazgo fue validado en el ratón, y se llevó a cabo después de los ensayos clínicos en los trasplantes de cordón umbilical humana 23,31-33 (NIH, Trials.gov Clínica, NCT00890500; NCT01627314). A través de varios estudios recientes, la genética química ha demostrado ser útil en el estudio de la enfermedad de riñón utilizando el pez cebra <shasta> 43. El riñón pez cebra ofrece un excelente paradigma para estudiar nefrogénesis o regeneración de la nefrona, la unidad funcional que comprende el riñón durante el desarrollo y la lesión renal aguda 43. Estructura Nephron está altamente conservada entre el pez cebra riñón embrionario y adulto riñón de mamífero 44-50. Varios estudios que examinan el riñón embrionario de pez cebra ilustran claramente su potencial inherente de traslación cuando se combina con la genética química. Una pantalla genética química se realizó en dos mutantes de pez cebra que se asignan a la PKD2 y ift172 genes, que se sabe que son actores clave en la enfermedad renal poliquística (PKD) 34. La pantalla resultó en la identificación de la desacetilasa pan-histona (HDAC) inhibidor de tricostatina A (TSA) como una molécula pequeña que podría anular los defectos morfológicos normalmente visto en los embriones mutantes. Un enfoque diferente adoptado por de Groh y colegas proyectó para los compuestos que Inducedema ed en embriones de pez cebra de tipo salvaje, lo que indicaría una alteración de la función renal 35. Después de identificar PTBA como un éxito, observaron que además de causar edema, PTBA también aumentó la expresión de pax2a, un marcador de progenitores renales. Es importante destacar que, a continuación, se muestra un derivado de PTBA optimizado para disminuir el porcentaje de mortalidad de adultos de pez cebra que sufrió el daño renal inducido por la gentamicina y, además, acelera la recuperación de los ratones que sufrían de daño renal 27. En conjunto, estas contribuciones de la genética química de pez cebra muestran los tipos de descubrimientos que se pueden hacer usando el método descrito en este protocolo.
Mientras que la investigación genética química tiene mérito sustancial, no está exenta de ciertos desafíos. Únicamente utilizando un enfoque de genética química puede hacer que sea complicado para determinar el gen o genes específicos que están siendo afectados por un compuesto. Incluso si se encuentra un objetivo (s), un SIbrecha gnificant puede permanecer entre la identificación de compuestos y la comprensión del mecanismo (s) de la acción en la que la molécula pequeña se comporta. Por ejemplo, puede ser difícil determinar el mecanismo en el que una molécula pequeña está actuando porque un solo compuesto es capaz de tener una gama de diferentes efectos dentro de un organismo. Sin embargo, con el advenimiento de las nuevas tecnologías y las pantallas de genética más químicos que se completó en el pez cebra, el problema de la determinación de un mecanismo se está reduciendo. Uno de los métodos para ayudar a determinar los efectos moleculares de compuestos identificados es seleccionar una biblioteca de medicamentos de bioactivos conocidos para la detección, donde los mecanismos pueden ser potencialmente deducen de los datos anteriormente anotado. Además, los algoritmos chemoinformatic, como puerta de Descubrimiento, están disponibles para el uso que se pueda comparar similitudes estructurales de un compuesto frente a una base de datos de compuestos con mecanismos atribuidos 14. Sin embargo, otra manera de dilucidar el mecanismo de un compuesto sería generar un microarray perfil después del tratamiento y luego consultar este perfil en una recopilación de perfiles de drogas de microarrays, como el Mapa de Conectividad, en busca de compuestos mecánicamente definidos que provocan un efecto similar 14. Este enfoque también se puede utilizar para identificar mutantes genéticos que tienen un efecto similar a la del compuesto de interés. Encontrar una conexión entre un compuesto y un mutante podría sugerir que el compuesto funciona molecularmente aguas arriba o aguas abajo del gen relacionado, lo que podría ser delineadas por tratamiento de los mutantes con el compuesto y morfolinos. Otra opción sería la espectrometría de masas, que continúa a ser más optimizado para el pez cebra. Este método puede ser usado para delinear los cambios específicos de la proteína o modificaciones después de la traducción después del tratamiento de drogas. Finalmente, las moléculas pequeñas o incluso bibliotecas enteras son a veces capaces de ser etiquetados para desplegable de parejas de unión. Es también digno de mención, que mientras que el mecanismo de cómo una pequeña molécula funciona is de importación significativa, hay medicamentos aprobados por la FDA para los que siguen siendo desconocidos los mecanismos.
Aunque el pez cebra presentan muchas similitudes con los mamíferos tanto genéticamente y fisiológicamente, todavía hay un problema de cruce de drogas 14. Un estudio investigó la capacidad de cruce de los éxitos de una pantalla de inhibidores del ciclo celular en embriones de pez cebra 50. La pantalla como resultado la identificación de 14 hits que antes eran desconocidos para poseer la actividad del ciclo celular. Fuera de estos 14 compuestos, 6 se encontró que tenían actividad del ciclo celular en ambos ensayos de cultivos celulares humanos y de pez cebra, 3 mostraron ser suero inactivado en ensayos de cultivo celular, 1 era activo sólo en las células de pez cebra, y 4 no tenía actividad en cualquiera pez cebra o ensayos de cultivos celulares humanos, pero sólo en todo el organismo del pez cebra. En particular, los compuestos 4 que sólo tenían actividad en el pez cebra demuestran que hay diferencias entre el pez cebra y mamíferos que pueden prohimordió el potencial de traslación de ciertos compuestos. Esta es una consideración importante a tener en cuenta, sin embargo, hay ejemplos de moléculas pequeñas, como PGE 2, que amplifica la capacidad de HSCs para injertar en los receptores humanos y PTBA derivados que mejoran la tasa de recuperación renal en mamíferos, proporcionando de este modo la prueba de principio de que cruce es posible 23,31-33.
A pesar de estas dificultades, la genética química y este enfoque mínima de recursos tiene mucho que ofrecer a la comunidad de investigadores. La genética química es particularmente útil en el pez cebra y seguirán desempeñando un papel fundamental en el interrogatorio vía molecular y el descubrimiento de fármacos. Pantallas químicos a base de dianas moleculares discretos han estado siempre sometida a una alta tasa de fracaso debido a lo que se conoce como el conjunto de adsorción, distribución, metabolismo, excreción y toxicológicos (ADMET) 51 propiedades. Pantallas químicos que utilizan el pez cebra paracentrarse en un proceso, en lugar de un objetivo discreto, puede eludir varios problemas ADMET e identificar compuestos que son eficaces en el contexto de todo el organismo. Con la creciente conjunto de recursos disponibles para la investigación de pez cebra, incluyendo cepas mutantes actuales y la capacidad de utilizar la edición de genoma para crear mutantes y transgénicos genéticos específicos, no hay prácticamente un número ilimitado de posibles pantallas genéticos químicas mediante el uso de pez cebra. Muchas bibliotecas químicas han sido curada, y colecciones palmo con bioactivos conocidos, compuestos novedosos, estructuralmente diversos y estructuralmente similares. Estos reactivos proporcionan una gran cantidad de interesantes oportunidades para las combinaciones de pantalla que están disponibles en la actualidad y es probable que crezca aún más en los próximos años. Con estas posibilidades en la mano, este protocolo manual y de alto rendimiento ofrece una forma práctica y fácil de usar para aumentar la capacidad de los grupos de investigación para llevar a cabo las pantallas genéticos químicos utilizando el pez cebra.
The authors have nothing to disclose.
Este trabajo fue apoyado por el financiamiento para el laboratorio de investigación Wingert entre los siguientes: Institutos Nacionales de Salud subvenciones K01 DK083512, DP2 OD008470, y R01 DK100237; March of Dimes Basilio O'Connor arranque Académico concesión de una subvención # 5-FY12-75; puesta en marcha de los fondos de la Universidad de Notre Dame Colegio de Ciencias y el Departamento de Ciencias Biológicas; y un regalo generoso de la Universidad de Notre Dame de Elizabeth y Michael Gallagher, en nombre de la familia Gallagher para fomentar la investigación con células madre. Los financiadores no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida de datos y análisis, decisión de publicar, o la preparación del manuscrito. Damos las gracias a Paul T. Kroeger, Jr. para proporcionar comentarios críticos sobre el manuscrito. Damos las gracias al personal del Departamento de Ciencias Biológicas por su apoyo, y el Centro de Investigación de Pez Cebra en Notre Dame por su dedicación excepcional en el cuidado y el bienestar de nuestra colonia de pez cebra. Por último, damos las gracias a los miembros de nuestra researlaboratorio ch por sus comentarios, discusiones y puntos de vista acerca de este trabajo.
JoVE 51922 MATERIALS | |||
Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
0.1 – 10 υL natural pipet tips | USA Scientific | 1111-3800 | |
1 X E3 | N/A | N/A | Generate using 50X E3 and DI water. |
1 X Pbst | N/A | N/A | Generate 0.1% Tween-20 in 1 X Pbs. |
10X Pbs | American Bioanalytical | AB11072 | |
12-well staining dish | BD-Falcon | 35-3225 | |
20X SSC | American Bioanalytical | AB13156 | |
24 well plate | BD-Falcon | 35-3226 | |
4% PFA/1X Pbs | N/A | N/A | Generate 4% PFA (w/v) in 1 X Pbs – boil then freeze and store at -20 °C. |
48 well plate | CytoOne | CC7672-7548 | |
50 X E3 | N/A | N/A | Generate 16.5 mM CaCl2, 16.5 mM MgSO4, 250mM NaCl, and 8.5mM KCl in DI water. |
96 deep well plate | VWR | 100-11-940 | |
96 well plate sealing mat | VWR | 10011-946 | |
anti-digoxigenin antibody | Roche | 11-093-274-910 | Keep at -20 °C. |
anti-fluorescein antibody | Roche | 11-426-338-910 | Keep at -20 °C. |
BCIP stock | Sigma | B8503 | Generate 50 mg/mL using 100% DMF – freeze then store at -20 °C. |
block solution | N/A | N/A | Generate 50 mL using 10 mL BSA (10%), 5 mL FCS, and 35 mL MABT. (Thaw BSA and FCS at 37 °C.) |
BSA (bovine serum albumin) stock | American Bioanalytical | AB00448 | Generate 10% BSA by stirring BSA flakes in MAB at room temperature then freeze and store at -20 °C. (Keep unused BSA flakes at 4 °C.) |
DIG/FLU labeled riboprobe in vitro transcription reaction reagents | Roche | 11175025910; 11685619910 | Consult the manufacturer procedure. |
DMF (dimethylformaldehyde) | American Bioanalytical | AB00450 | |
DNase 1 inhibitor, 10 X DNase 1buffer | Roche | 4716728001 | |
embryo incubation dish | Falcon | 35-1005 | |
epT.I.P.S 20-300 υL | Eppendorf | 22492284 | |
Ethanol (EtOH) | Sigma | E7023 | Generate 50mL of 70% EtOH with molecular grade H2O and 100% EtOH then store at -20 °C. |
FCS (fetal calf serum) stock | Invitrogen | 16140089 | Keep at -20 °C. |
filter sterilization unit | Corning | 430516 | 0.45 υm CA / 1L volume |
fine forceps | Roboz | RS-1050 | |
flat-bottom microcentrifuge tube | VWR | 87003-300; 87003-298 | |
Formamide | American Bioanalytical | AB00600 | Keep at -20 °C. |
glass basin 90 x 50 | Kimax Kimble | 23000 | |
glass pipette | VWR | 14673-010 | |
glass vial | Wheaton | 225012 | |
glycerol | Sigma | G7893 | |
glycine | Sigma | G8898 | |
glycogen | Roche | 10901393001 | |
HYB+ | Generate 50% formamide, 0.1% Tween-20, 5X SSC, 5 mg/mL yeast torula RNA, and 50 υL/υL heparin | ||
INT stock | Sigma | I8377 | Generate 55mg/mL using 70% DMF and 30% H2O – freeze then store at -20 °C. |
MAB | Generate by adding 55.0 g Trisma base, 8 mL of 1M Tric-HCl pH 9.5, 23.2 g maleic acid, and 17.5 g NaCl to 1.5 L of deionized H2O. Then fill with deionized H2O to 2L and autoclave. | ||
MABT | N/A | N/A | Generate 0.1% Tween-20 in MAB |
MeOH | Sigma | 34860-4L | |
mesh tea strainer | English Tea Store | SKU #ASTR_KEN, MPN#1705 | |
molecular grade distilled water | Mediatech | 25-055-CM | |
multi 8-channel pipette 0.5 – 10 υL | Eppendorf | 3122000.019 | |
multi 8-channel pipette 30 – 300 υL | Eppendorf | 3122000.051 | |
nanodrop | Thermo | ND-2000c | |
NBT stock | Sigma | N6876 | Generate 50mg/mL using 70% DMF and 20% H2O – freeze then store at -20 °C. |
paraformaldehyde | Electron Microscopy Services | 19210 | |
PCR-Film adhesive | Eppendorf | 30127.48 | |
plate container (Pencil Box) | Sterilite | 1722 | |
pre-staining buffer | N/A | N/A | Generate 01% Tween-20, 50 mM MgCl2, 100 mM NaCl, and 100 mM Tris pH 9.5. (Make fresh for use each time.) |
Pronase | Roche | 11459643001 | Generate 50mg/mL using E3, freeze then store at -20 °C. |
Proteinase K | Roche | 03-115-879-001 | Generate 10mg/mL in DI water then freeze and store at -20 °C. |
RNase 1 inhibitor | Roche | 3335399001 | |
rubber bulb | Fisherbrand Fisher Scientific | 03-448-22 | |
small plastic Petri dish | Corning | 430589, 430588 | |
SP6 RNA polymerase | Roche | 11487671001 | |
staining solution-purple | N/A | N/A | Generate using 45 υL of NBT and 35 υL of BCIP for every 10 mL needed in pre-staining buffer. |
staining solution-red | N/A | N/A | Generate using 31.5 υL of INT and 35 υL of BCIP for every 10 mL needed in pre-staining buffer. |
stereomicroscope | Nikon | SMZ645, SMZ1000 | |
T3 RNA polymerase | Roche | 11031171001 | |
T7 RNA polymerase | Roche | 10881775001 | |
transfer pipet | Samco | 202, 204 | |
Tween-20 stock | American Bioanalytical | AB02038 | |
waterbath | Thermo | 51221073 | (Model # 2831) |