Summary

Visualisierung nichtlytischen Exozytose<em> Cryptococcus neoformans</em> Von Makrophagen mit digitalen Lichtmikroskopie

Published: October 21, 2014
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Summary

Wir beschreiben, wie Makrophagen C. visualisieren neoformans (Cn) Interaktionen in Echtzeit, wobei ein besonderer Schwerpunkt auf den Prozess der nicht-lytischen Exozytose mit digitalen Lichtmikroskopie. Unter Verwendung dieser Technik einzeln infizierten Makrophagen untersucht, um verschiedene Aspekte dieses Phänomens festzustellen ist.

Abstract

Viele Aspekte der Infektion von Makrophagen durch Cryptococcus neoformans wurden ausgiebig untersucht und gut definiert. Jedoch eine bestimmte Interaktion, die nicht klar verstanden wird, ist nicht-lytischen Exozytose. In diesem Verfahren werden Hefezellen in den extrazellulären Raum durch eine schlecht verstandenen Mechanismus, der sowohl die Makrophagen und Cn lebensfähigen Blätter freigegeben. Hier beschreiben wir, wie man eine große Anzahl von infizierten Makrophagen individuell für eine 24-Stunden-Infektionsperiode von Zeitraffer-Mikroskopie zu folgen. Infizierten Makrophagen werden in einer Wärmekammer mit einem CO 2 Atmosphäre in einem Mikroskop, die die gleichen Bedingungen wie einem Zellkulturbrutschrank bietet angebracht gebracht. Live digitalen Mikroskopie kann Informationen über die dynamischen Wechselwirkungen zwischen einem Wirt und Pathogen, die nicht von statischen Bildern ist. In der Lage, jede infizierte Zelle visualisieren können Hinweise darauf, wie Makrophagen behandeln Pilzinfektionen stellen, und umgekehrt. Diese Technik isa leistungsfähiges Werkzeug bei der Untersuchung der Dynamik, die hinter einem komplexen Phänomen sind.

Introduction

Die Phasen der Pilzinfektion zwischen Cryptococcus-Zellen und Makrophagen sind gut dokumentiert 1-3. Nach Hefezellen werden durch Makrophagen aufgenommen werden, kann eine Vielzahl von Wechselwirkungen auftreten: der Makrophagen kann lysieren Freigabe seiner Pilzbelastung in den extrazellulären Raum, oder es könnte die Infektion, indem die Hefe-Zellen innerhalb der Grenzen seiner zellulären Membran 4 zu steuern. Nichtlytischen Exozytose, ein Verfahren, bei dem ein Makrophage getilgt einige oder alle der Cryptococcus-Zellen in die Umgebung oder eine benachbarte Zelle, und beide Wirt und Pathogen lebensfähig bleiben 5: jedoch seit einigen Jahren ein neues Ergebnis wurde unabhängig durch zwei Gruppen beschrieben -8. Mehrere Studien haben versucht, die molekularen Mechanismen hinter dieser Interaktion zu verstehen, aber wir haben noch nicht über einen vollen Griff auf, was treibt dieses Phänomen.

Die Fähigkeit, Bilder in Echtzeit zu erfassen und anschließend analysieren mehrere infizierened Makrophagen ermöglicht es, viele Fragen zu den physikalischen Eigenschaften umliegenden nicht-lytischen Exozytose in Bezug auf Timing, Raumkapazität, Veränderung der Morphologie und auch Stress von Makrophagen während einer Pilzinfektion zu beantworten. Indem die Zellen in einer Umgebung, die vergleichbar mit der von einem Inkubator untergebracht ist, so können wir die dynamische Natur der Makrophagen-Pilzzelle Wechselwirkungen erblicken. Forscher haben diese Technik verwendet, um verschiedene Komponenten dieses Prozesses zu studieren. Die Rolle der Phagosom in diesem Prozess wurde deutlich gemacht mit Fluoreszenzfärbung und Aktin Blockern 9, während eine andere Gruppe verwendet diese Methode, um zu zeigen, dass nicht-lytischen Exozytose wurde in Zellen, die hatten die Waschkeimbildungsproteindomänen gelöscht 10 blockiert. Die Wirkung der Cytokine Signaling hat auch festgestellt worden mit Echtzeit-Mikroskopie 11. Dieses Verfahren ist nicht beschränkt auf C. neoformans, wie es auch mit Candida albicans beobachtet, another Pilzkrankheitserreger, der die Fähigkeit, Makrophagen 12 infizieren. Diese Ergebnisse sind Beispiele dafür, wie dieses Verfahren eine Fülle von Informationen zu einem Bereich, den wir wissen so wenig über ist.

Protocol

Alle Tier Arbeit wurde in Übereinstimmung mit den Vorschriften und Richtlinien des Institut für Tierwissenschaften an der Albert-Einstein-College of Medicine durchgeführt. 1. Wachstumsbedingungen von C. neoformans H99 (Serotyp A) Wachsen einzelne C. neoformans (Cn) Kolonien auf Sabouraud-Agar-Platten. Ein Tag vor dem Experiment, wählen Sie eine Kolonie und zu impfen 10 ml Sabouraud-Bouillon. Ermöglichen Kultur über Nacht bei 37 ° C wach…

Representative Results

Die Bilder, die diese Technik kann in einer Vielzahl von Möglichkeiten, Informationen rund um das, was passiert, nachdem Zellen phagozytiert C. sammeln analysierende neoformans. Wie in Figur 1 zu sehen ist, gibt es etwa 100 Makrophagen, die entweder infiziert oder nicht infiziert sind. Jede dieser Makrophagen gibt dem Zuschauer die Möglichkeit, Wirt-Pathogen-Interaktionen auf einer mikroskopischen Ebene sehr zu studieren. Wie die Figuren 2 und 3 zeig…

Discussion

Hier haben wir eine Methode, mit der Pilz-Makrophagen-Interaktionen können aufgezeichnet und in Echtzeit über einen 24-Stunden-Zeitraum analysiert werden beschrieben. Unser Labor hat dieses Protokoll verwendet, um viele der zeitlichen Aspekte des nicht-lytischen Exozytose zu studieren und wird auch weiterhin in Echtzeit-Mikroskopie zu verwenden, um die morphologischen Komponenten, die diesen Prozess umgeben ermitteln.

Für diese Technik, um optimale Ergebnisse zu erhalten, sollte besondere…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Forschung wurde zum Teil durch NIH Auszeichnungen 5T32AI07506, 5R01AI033774, 5R37AI033142, 5R01AI052733 unterstützt.

Materials

Sabouraud Dextrose Agar BD DF0109-17-1
Sabouraud Dextrose Broth BD DF0382-17-9
Dubelcco's Modified Eagle's Medium(DMEM) Corning Cellgro 10-013-CV
Fetal Calf Serum ( FCS)  Atlanta Biologicals S12450
NCTC 109 Invitrogen 21340-039
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140-122
HEPES Buffer Corning Cellgro 25-060-Cl
Glutamax Invitrogen 35050-061
Non-essential Amino Acids Corning Cellgro 25-025-Cl
2-Mercaptoethanol Invitrogen 21985-023 Toxic
3003 Tissue Culture Petri Dishes  Fisher Scientific  08772E
CellStripper Corning Cellgro 25-056-Cl
Mat-tek Glass Bottom Culture Dishes MatTek P35GC-1.5-14-C
LPS Sigma L3137
Mouse IFN-g Roche NC 9222016
mAb 18B7        Non-commerical antibody produced in our lab
Axiovert 200M Microscope with Incubating Chamber Zeiss

References

  1. Voelz, K., May, R. C. Cryptococcal Interactions With the Host Immune System. Eukaryotic cell. 9 (6), 835-846 (2010).
  2. Johnston, S. A., May, R. C. Cryptococcus interactions with macrophages: evasion and manipulation of the phagosome by a fungal pathogen. Cellular microbiology. 15 (3), 403-411 (2012).
  3. Sabiiti, W., May, R. C. Mechanisms of infection by the human fungal pathogen Cryptococcus neoformans. Future microbiology. 7 (11), 1297-1313 (2012).
  4. Bliska, J. B., Casadevall, A. Intracellular pathogenic bacteria and fungi — a case of convergent evolution. Nature Reviews Microbiology. 7, 165-171 (2008).
  5. Alvarez, M., Casadevall, A. Cell-to-cell spread and massive vacuole formation after Cryptococcus neoformans infection of murine macrophages. BMC immunology. 8 (1), 16 (2007).
  6. Ma, H., Croudace, J. E., Lammas, D. A., May, R. C. Direct cell-to-cell spread of a pathogenic yeast. BMC immunology. 8, 15 (2007).
  7. Alvarez, M., Casadevall, A. Phagosome extrusion and host-cell survival after Cryptococcus neoformans phagocytosis by macrophages. Curr Biol. 16 (21), 2161-2165 (2006).
  8. Ma, H., Croudace, J. E., Lammas, D. A., May, R. C. Expulsion of live pathogenic yeast by macrophages. Curr Biol. 16 (21), 2156-2160 (2006).
  9. Johnston, S. A., May, R. C. The human fungal pathogen Cryptococcus neoformans escapes macrophages by a phagosome emptying mechanism that is inhibited by Arp2/3 complex-mediated actin polymerisation. PLoS pathogens. 6 (8), (2010).
  10. Carnell, M., et al. Actin polymerization driven by WASH causes V-ATPase retrieval and vesicle neutralization before exocytosis. The Journal of cell biology. 193 (5), 831-839 (2011).
  11. Voelz, K., Lammas, D. A., May, R. C. Cytokine signaling regulates the outcome of intracellular macrophage parasitism by Cryptococcus neoformans. Infection and immunity. 77 (8), 3450-3457 (2009).
  12. Bain, M. J., Lewis, E. L., Okai, B., Quinn, J., Gow, A. R. N., Erwig, L. Non-lytic expulsion/exocytosis of Candida albicans from macrophages. Fungal genetics and biology. 49 (9), 677-678 (2012).

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Cite This Article
Stukes, S., Casadevall, A. Visualizing Non-lytic Exocytosis of Cryptococcus neoformans from Macrophages Using Digital Light Microscopy. J. Vis. Exp. (92), e52084, doi:10.3791/52084 (2014).

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