Storstilet zebrafisk Embryonale Heart Dissektion for Transkriptionel Analysis
Summary
At analysere kardiale genekspressionsprofiler under zebrafisk hjerte udvikling, er den samlede RNA udvindes fra isolerede hjerter. Her præsenterer vi en protokol til opsamling funktionelle / slå hjerter ved hurtig manuel dissektion fra zebrafisk embryoner for at få hjerte-specifikke mRNA.
Abstract
Zebrafisken embryoniske hjerte er sammensat af kun et par hundrede celler, der kun repræsenterer en lille brøkdel af hele embryoet. Derfor, for at forhindre, at hjerte-transkriptomet bliver maskeret af den globale embryonale transkriptomet, er det nødvendigt at indsamle et tilstrækkeligt antal hjerter for yderligere analyser. Som zebrafisk hjerte-udvikling forløber hurtigt, hjerte indsamling og RNA-ekstraktionsmetoder skal være hurtig for at sikre ensartethed af prøverne. Her præsenterer vi en hurtig manuel dissektion protokol til indsamling funktionelle / slå hjerter fra zebrafisk embryoner. Dette er en væsentlig forudsætning for efterfølgende hjerte–specifik RNA-ekstraktion for at bestemme hjertets specifikke genekspressionsniveauer ved transkriptom analyser, såsom kvantitativ realtids-polymerasekædereaktion (RT-qPCR). Metoden er baseret på differentielle klæbeegenskaber zebrafisk embryoniske hjerte sammenlignet med andre væv; dette giver mulighed for hurtig grafisisk separation af hjerte fra ekstrakardiale væv ved en kombination af strømningsteknisk forskydningskraft afbrydelse trinvis filtrering og manuel samling af transgene fluorescensmærkede hjerter.
Introduction
Zebrafisk (Danio rerio) er meget udbredt i udviklingsmæssige biologi til at studere organogenesis in vivo på grund af sin hurtige, gennemsigtig og ekstrautrin fosterudvikling, kombineret med lille størrelse og tilgængeligheden af transgene reporter linjer med vævsspecifik ekspression af fluorescerende proteiner. Denne lille hvirveldyr er særlig velegnet til at studere hjerte udvikling, fordi iltning af den tidlige zebrafisk embryo ikke er afhængig af hjerterytme og blodgennemstrømning; disse funktioner har tilladt karakterisering af et stort antal cardiovaskulære mutanter 1,2 og zebrafisk er nu almindeligt anerkendt model organisme for at studere hjertesygdomme 3.
At studere genekspression under fosterudviklingen, er udskrifter almindeligvis analyseret af hel-mount in situ hybridisering (ønske) 4, RT-qPCR 5, microarrays 6 eller næste generation sekventering (RNA-Seq) 7. MensWISH tillader en rumligt tidsmæssig analyse af genekspression i hele embryo er transkriptniveauer vurderes normalt ved RT-qPCR, microarrays eller RNA-Seq tilgange. Men disse metoder kræver væv berigelse for specifik genekspression profilering.
Da den zebrafisk embryonale hjerte udgør en lille brøkdel af hele embryo, transkriptom undersøgelser under hjerte- udvikling kræver en protokol for dissektion og berigelse af hjerter. Desuden, for at opnå fysiologisk relevante data, er det vigtigt at opretholde hjertevævet fuldt funktionel indtil RNA-ekstraktion. Her beskriver vi en protokol for hurtigt at isolere fysiologisk normal og slå hjerter fra hundredvis af zebrafisk embryoner effektivt at opnå høj kvalitet RNA-prøver til yderligere analyser. Den nuværende metode er baseret på den protokol, rapporteret af Burns og MacRae 2006 8. Til berigelse af hjertevæv, begge metoder bruger en transgen myocardial reporter linjeog drage fordel af den differentierede adhæsionsegenskaber af zebrafisk embryonale hjerter versus andre væv. Kort fortalt ved pipettering mange embryoner op og ned gennem en smal pipettespids, hjerter samtidig frigivet fra embryonale organer og efterfølgende adskilt fra embryonale vragrester i to hurtig filtrering trin; fluorescensmærkede hjerter derefter manuelt sorteret fra resterende snavs og opsamles til videre forarbejdning.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne protokol giver mulighed for hurtig berigelse af zebrafisk embryonale hjertevæv til genekspression analyser. Mængden og kvaliteten af hjerte–specifikke RNA-prøve i høj grad afhænger af et par afgørende trin: først, er mængden af prøven væsentligt forbedret, hvis tab af hjerter forhindres på alle trin i protokollen, da RNA oprensning kun vil arbejde med tilstrækkelig udgangsmateriale. For det andet, renheden af prøven, der afhænger helt af forsøgslederen, bestemmes ved at sortere og…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to thank C. Burns, C. McRae for outlining the basic principle of this purification protocol, and F. Priller for initial implementation of this method in our lab. S.A.-S. is supported by a Heisenberg professorship of the Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG). This work was supported by DFG grant SE2016/7-1.
Materials
| Equipment for raising fish and collecting eggs | see the Zebrafish Book11 for details | ||
| Fluorescence stereomicroscope | |||
| Refrigerated Microcentrifuge | |||
| UV-Spectrophotometer | eg. Thermo Scientific Nanodrop 2000 | ||
| Nucleic acid electrophoresis chamber | |||
| Petri dishes 4cm Ø, coated with 1% agarose in E3 medium | |||
| Micropipettes and tips (P20, P100, P1000) | |||
| 1,5ml centrifugation tubes | |||
| 15ml and 50ml centrifugation tubes | |||
| Pair of Dumont #5 forceps | |||
| ExactaCruz™ Round Gel Loading Tips in Sterile Rack, 1-200μl | Santa Cruz | sc-201732 | |
| 100 μm filter (BD Falcon 100 mm Cell Strainer) | BD Biosciences | 352360 | |
| 30 μm filter (Pre-Separation Filters-30 µm) | Miltenyi Biotec | 130-041-407 | |
| Phase lock gel, heavy, 1,5ml tubes | Prime | 2302810 | |
| Egg water medium | 60μg/ml Instant Ocean Sea Salts in ddH2O, 0.00001% (w/v) Methylene Blue | ||
| E3 medium | 5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4 | ||
| Tricaine (3-amino benzoic acidethylester) | Sigma-Aldrich | A-5040 | 4mg/ml Tricaine stock solution, pH 7 |
| 1% agarose (in E3 medium) | |||
| 1% agarose gel (in TBE buffer) | |||
| Leibovitz´s L-15 medium | Gibco | 21083-027 | |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | Sigma | F4135 | |
| RNAlater | Ambion | AM7020 | |
| Trizol | Ambion | 1559606 | |
| Glycogen | Invitrogen | 10814-010 | 20 µg/µL in RNase-free water |
| chloroform | |||
| isopropanol | |||
| 75% ethanol (in DEPC-ddH2O) | |||
| Nuclease-free water or sterilized DEPC treated ddH2O | |||
| Nucleic acid loading buffer | |||
| TBE (Tris/Borate/EDTA) buffer for electrophoresis |
References
- Stainier, D. Y., et al. Mutations affecting the formation and function of the cardiovascular system in the zebrafish embryo. Development. 123, 285-292 (1996).
- Chen, J. N., et al. Mutations affecting the cardiovascular system and other internal organs in zebrafish. Development. 123, 293-302 (1996).
- Bakkers, J. Zebrafish as a model to study cardiac development and human cardiac disease. Cardiovasc Res. 91, 279-288 (2011).
- Jowett, T., Lettice, L. Whole-mount in situ hybridizations on zebrafish embryos using a mixture of digoxigenin- and fluorescein-labelled probes. Trends Genet. 10, 73-74 (1994).
- Gibson, U. E., Heid, C. A., Williams, P. M. A novel method for real time quantitative RT-PCR. Genome Res. 6, 995-1001 (1996).
- Epstein, C. B., Butow, R. A. Microarray technology – enhanced versatility, persistent challenge. Curr Opin Biotechnol. 11, 36-41 (2000).
- Qian, X., Ba, Y., Zhuang, Q., Zhong, G. RNA-Seq Technology and Its Application in Fish Transcriptomics. OMICS. 18, 98-110 (2014).
- Burns, C. G., MacRae, C. A. Purification of hearts from zebrafish embryos. Biotechniques. 40, 274-278 (2006).
- Huang, C. J., Tu, C. T., Hsiao, C. D., Hsieh, F. J., Tsai, H. J. Germ-line transmission of a myocardium-specific GFP transgene reveals critical regulatory elements in the cardiac myosin light chain 2 promoter of zebrafish. Dev Dyn. 228, 30-40 (2003).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203, 253-310 (1995).
- Westerfield, M. . The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2000).
- Veerkamp, J., et al. Unilateral dampening of Bmp activity by nodal generates cardiac left-right asymmetry). Dev Cell. 24, 660-667 (2013).
- Jin, S. W., Beis, D., Mitchell, T., Chen, J. N., Stainier, D. Y. Cellular and molecular analyses of vascular tube and lumen formation in zebrafish. Development. 132, 5199-5209 (2005).
- Brownlie, A., et al. Characterization of embryonic globin genes of the zebrafish. Dev Biol. 255, 48-61 (2003).
- Marvin, M., et al. Developmental expression patterns of the zebrafish small heat shock proteins. Dev Dyn. 237, 454-463 (2008).
- Lam, C. S., Marz, M., Strahle, U. gfap and nestin reporter lines reveal characteristics of neural progenitors in the adult zebrafish brain. Dev Dyn. 238, 475-486 (2009).
- Wang, Y., et al. Moesin1 and Ve-cadherin are required in endothelial cells during in vivo tubulogenesis. Development. 137, 3119-3128 (2010).
- Heiman, M., et al. A translational profiling approach for the molecular characterization of CNS cell types. Cell. 135, 738-748 (2008).
- Tryon, R. C., Pisat, N., Johnson, S. L., Dougherty, J. D. Development of translating ribosome affinity purification for zebrafish. Genesis. 51, 187-192 (2013).
