בקנה מידה גדולה דג הזברה עוברי לב Dissection לניתוח תעתיק
Summary
כדי לנתח פרופילי ביטוי גני לב במהלך התפתחות לב דג הזברה, רנ"א הכל יש להיעקר מלב מבודד. כאן, אנו מציגים פרוטוקול לאיסוף לבבות פונקציונליים / מכות על ידי נתיחה במדריך מהירה מעוברי דג הזברה להשיג mRNA לב ספציפי.
Abstract
הלב העוברי דג הזברה מורכב מרק כמה מאה תאים, המייצג רק חלק קטן של כל העובר. לכן, כדי למנוע transcriptome הלב מלהיות רעול פנים על ידי transcriptome העוברית הגלובלית, יש צורך לאסוף כמות מספקת של לבבות לניתוח נוסף. יתר על כן, כהתפתחות לב דג הזברה ממשיכה במהירות, אוסף לב ושיטות מיצוי RNA צריכים להיות מהיר כדי להבטיח אחידות של הדגימות. כאן, אנו מציגים פרוטוקול לנתיחה במדריך מהיר לאיסוף לבבות פונקציונליים / מכות מעוברי דג הזברה. זהו תנאים הכרחיים להפקת RNA לב ספציפית שלאחר מכן כדי לקבוע את רמות ביטוי גני לב ספציפיות על ידי transcriptome ניתוחים, כגון תגובה בזמן אמת כמותי שרשרת של פולימראז (RT-qPCR). השיטה מבוססת על מאפיינים דבקים ההפרש של הלב העוברי דג הזברה בהשוואה לרקמות אחרות; זה מאפשר לPHY המהירהפרדת sical של לב מרקמת extracardiac על ידי שילוב של הפרעה fluidic כוח הגזירה, סינון בשלבים ואיסוף ידני של לבבות שכותרתו fluorescently מהונדסים.
Introduction
דג הזברה (Danio rerio) נעשתה שימוש נרחב בביולוגיה התפתחותית ללמוד organogenesis in vivo בשל התפתחותה מהירה, שקופה וextrauterine העוברית, בשילוב עם גודל קטן ואת הזמינות של קווי כתב מהונדסים עם ביטוי רקמות הספציפיות של חלבוני ניאון. חוליות קטנות זה היא גם מתאים במיוחד ללמוד פיתוח לב כי חמצון של עובר דג הזברה המוקדם אינו מסתמך על קצב לב וזרימת דם; תכונות אלה אפשרו את האפיון של מספר רב של מוטציות לב וכלי דם 1,2 והדג הזברה היא עכשיו אורגניזם מודל להכרה רחבה ללמוד מחלות לב 3.
ללמוד ביטוי גנים במהלך התפתחות עוברית, תעתיקים מנותחים בדרך כלל על ידי כל הר הכלאה באתר (רוצה) 4, RT-qPCR 5, 6 microarrays, או רצף הדור הבא (RNA-Seq) 7. בעודמאחלים מאפשר ניתוח של מרחב וזמן של ביטוי גנים בכל העובר, רמות תמליל בדרך כלל הוערכו על ידי RT-qPCR, microarrays או גישות RNA-Seq. עם זאת, שיטות אלו דורשות העשרת רקמה לפרופיל ביטוי גנים ספציפי.
מאז הלב העוברי דג הזברה מייצג חלק קטן מכל העובר, מחקרי transcriptome במהלך התפתחות לב דורשים פרוטוקול לנתיחה והעשרה של לבבות. בנוסף, כדי לקבל נתונים רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית, חשוב לשמור על רקמת הלב מתפקדת במלואה עד מיצוי RNA. כאן, אנו מתארים פרוטוקול למהירות בידוד מבחינה פיזיולוגית נורמלי ולבבות פועמים ממאה עוברי דג הזברה להשיג דגימות RNA באיכות גבוהה ביעילות לניתוח נוסף. השיטה הנוכחית מתבססת על הפרוטוקול שדווח על ידי ברנס וMacRae, 2006 8. להעשרת רקמת לב, שתי השיטות להשתמש בקו כתב שריר לב מהונדסולנצל את תכונות הידבקות ההפרש של לב עוברי דג הזברה לעומת רקמות אחרות. בקצרה, על ידי pipetting עוברים רבים מעלה ומטה באמצעות פיפטה קצה צר, לבבות משתחררים בו-זמנית מגופים עובריים ולאחר מכן הופרדו מעוברית פסולת בשני שלבי סינון מהירים; לבבות שכותרתו fluorescently מכן מסודרים באופן ידני מפסולת שנותרה ושנאספו לעיבוד נוסף.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול זה מאפשר להעשרה המהירה של רקמת לב עוברית דג הזברה לביטוי גני מנתח. הכמות והאיכות של מדגם RNA לב הספציפי מאוד תלויה במספר צעדים חיוניים: ראשון, כמות המדגם הוא השתפר מאוד אם אובדן הלבבות נמנע בכל שלב של הפרוטוקול, מאז טיהור RNA תעבוד רק עם מספיק חומר מוצא. שנית, את ה…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to thank C. Burns, C. McRae for outlining the basic principle of this purification protocol, and F. Priller for initial implementation of this method in our lab. S.A.-S. is supported by a Heisenberg professorship of the Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG). This work was supported by DFG grant SE2016/7-1.
Materials
| Equipment for raising fish and collecting eggs | see the Zebrafish Book11 for details | ||
| Fluorescence stereomicroscope | |||
| Refrigerated Microcentrifuge | |||
| UV-Spectrophotometer | eg. Thermo Scientific Nanodrop 2000 | ||
| Nucleic acid electrophoresis chamber | |||
| Petri dishes 4cm Ø, coated with 1% agarose in E3 medium | |||
| Micropipettes and tips (P20, P100, P1000) | |||
| 1,5ml centrifugation tubes | |||
| 15ml and 50ml centrifugation tubes | |||
| Pair of Dumont #5 forceps | |||
| ExactaCruz™ Round Gel Loading Tips in Sterile Rack, 1-200μl | Santa Cruz | sc-201732 | |
| 100 μm filter (BD Falcon 100 mm Cell Strainer) | BD Biosciences | 352360 | |
| 30 μm filter (Pre-Separation Filters-30 µm) | Miltenyi Biotec | 130-041-407 | |
| Phase lock gel, heavy, 1,5ml tubes | Prime | 2302810 | |
| Egg water medium | 60μg/ml Instant Ocean Sea Salts in ddH2O, 0.00001% (w/v) Methylene Blue | ||
| E3 medium | 5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4 | ||
| Tricaine (3-amino benzoic acidethylester) | Sigma-Aldrich | A-5040 | 4mg/ml Tricaine stock solution, pH 7 |
| 1% agarose (in E3 medium) | |||
| 1% agarose gel (in TBE buffer) | |||
| Leibovitz´s L-15 medium | Gibco | 21083-027 | |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | Sigma | F4135 | |
| RNAlater | Ambion | AM7020 | |
| Trizol | Ambion | 1559606 | |
| Glycogen | Invitrogen | 10814-010 | 20 µg/µL in RNase-free water |
| chloroform | |||
| isopropanol | |||
| 75% ethanol (in DEPC-ddH2O) | |||
| Nuclease-free water or sterilized DEPC treated ddH2O | |||
| Nucleic acid loading buffer | |||
| TBE (Tris/Borate/EDTA) buffer for electrophoresis |
References
- Stainier, D. Y., et al. Mutations affecting the formation and function of the cardiovascular system in the zebrafish embryo. Development. 123, 285-292 (1996).
- Chen, J. N., et al. Mutations affecting the cardiovascular system and other internal organs in zebrafish. Development. 123, 293-302 (1996).
- Bakkers, J. Zebrafish as a model to study cardiac development and human cardiac disease. Cardiovasc Res. 91, 279-288 (2011).
- Jowett, T., Lettice, L. Whole-mount in situ hybridizations on zebrafish embryos using a mixture of digoxigenin- and fluorescein-labelled probes. Trends Genet. 10, 73-74 (1994).
- Gibson, U. E., Heid, C. A., Williams, P. M. A novel method for real time quantitative RT-PCR. Genome Res. 6, 995-1001 (1996).
- Epstein, C. B., Butow, R. A. Microarray technology – enhanced versatility, persistent challenge. Curr Opin Biotechnol. 11, 36-41 (2000).
- Qian, X., Ba, Y., Zhuang, Q., Zhong, G. RNA-Seq Technology and Its Application in Fish Transcriptomics. OMICS. 18, 98-110 (2014).
- Burns, C. G., MacRae, C. A. Purification of hearts from zebrafish embryos. Biotechniques. 40, 274-278 (2006).
- Huang, C. J., Tu, C. T., Hsiao, C. D., Hsieh, F. J., Tsai, H. J. Germ-line transmission of a myocardium-specific GFP transgene reveals critical regulatory elements in the cardiac myosin light chain 2 promoter of zebrafish. Dev Dyn. 228, 30-40 (2003).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203, 253-310 (1995).
- Westerfield, M. . The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2000).
- Veerkamp, J., et al. Unilateral dampening of Bmp activity by nodal generates cardiac left-right asymmetry). Dev Cell. 24, 660-667 (2013).
- Jin, S. W., Beis, D., Mitchell, T., Chen, J. N., Stainier, D. Y. Cellular and molecular analyses of vascular tube and lumen formation in zebrafish. Development. 132, 5199-5209 (2005).
- Brownlie, A., et al. Characterization of embryonic globin genes of the zebrafish. Dev Biol. 255, 48-61 (2003).
- Marvin, M., et al. Developmental expression patterns of the zebrafish small heat shock proteins. Dev Dyn. 237, 454-463 (2008).
- Lam, C. S., Marz, M., Strahle, U. gfap and nestin reporter lines reveal characteristics of neural progenitors in the adult zebrafish brain. Dev Dyn. 238, 475-486 (2009).
- Wang, Y., et al. Moesin1 and Ve-cadherin are required in endothelial cells during in vivo tubulogenesis. Development. 137, 3119-3128 (2010).
- Heiman, M., et al. A translational profiling approach for the molecular characterization of CNS cell types. Cell. 135, 738-748 (2008).
- Tryon, R. C., Pisat, N., Johnson, S. L., Dougherty, J. D. Development of translating ribosome affinity purification for zebrafish. Genesis. 51, 187-192 (2013).
