Storskalig Zebrafish Embryonala Hjärta Dissection för Transkriptionell Analys
Summary
För att analysera hjärt genuttrycksprofilerna under zebrafisk hjärta utveckling har totalt RNA extraheras från isolerade hjärtan. Här presenterar vi ett protokoll för insamling funktionella / slående hjärtan genom snabb manuell dissektion från zebrafisk embryon för att få hjärt-specifikt mRNA.
Abstract
Den zebrafisk embryonala hjärtat består av bara några hundra celler, vilket motsvarar endast en liten del av hela embryot. Därför, för att förhindra hjärt transkriptom från att maskeras av den globala embryonala transkriptom, är det nödvändigt att samla in tillräckligt många hjärtan för ytterligare analyser. Eftersom zebrafisk hjärt utveckling fortskrider snabbt, hjärt insamling och RNA utvinningsmetoder måste vara snabb för att säkerställa homogenitet av proverna. Här presenterar vi en snabb manuell dissektion protokoll för insamling funktionella / slående hjärtan från zebrafisk embryon. Detta är en viktig förutsättning för efterföljande hjärtspecifika RNA-extraktion för att bestämma hjärtspecifika genuttryck nivåer genom transkriptom analyser, såsom kvantitativ realtids-polymeras kedjereaktion (RT-qPCR). Metoden är baserad på differentialvidhäftningsegenskaper hos zebrafisk embryonala hjärtat jämfört med andra vävnader; Detta möjliggör snabb physiskt separation av hjärt från extra hjärtvävnad genom en kombination av fluid skjuvkraft störningar, stegvis filtrering och manuell insamling av transgena fluorescerande hjärtan.
Introduction
Zebrafisk (Danio rerio) används ofta i utvecklingsbiologi för att studera organogenes in vivo på grund av dess snabba, öppna och utomkveds embryonal utveckling, kombinerat med liten storlek och tillgången till transgena reporter linjer med vävnadsspecifikt uttryck av fluorescerande proteiner. Denna lilla ryggradsdjur är särskilt väl lämpad för att studera hjärtutveckling eftersom syresättning av tidiga zebrafisk embryot inte förlitar sig på hjärtslag och blodflöde; Dessa funktioner har tillåtit karakterisering av ett stort antal kardiovaskulära mutanter 1,2 och zebrafisk är nu en allmänt erkänd modellorganism för att studera hjärtsjukdomar 3.
För att studera genuttryck under fosterutvecklingen, är avskrifter vanligen analyseras genom hela montera in situ hybridisering (WISH) 4, RT-qPCR 5, mikromatriser 6, eller nästa generations sekvensering (RNA-Seq) 7. MedanWISH tillåter en spatial-temporal analys av genuttryck inom hela embryot, är transkriptnivåer normalt bedöms med RT-qPCR, mikromatriser eller RNA-Seq tillvägagångssätt. Men dessa metoder kräver vävnads anrikning för specifik genuttryck profilering.
Eftersom zebrafisk embryonala hjärtat representerar en liten del av hela embryot, transkriptom studier under hjärt utveckling kräver ett protokoll för dissektion och anrikning av hjärtan. Dessutom, för att erhålla fysiologiskt relevanta data är det viktigt att upprätthålla hjärtvävnaden fullt fungerande tills RNA-extraktion. Här beskriver vi ett protokoll för att snabbt isolera fysiologiskt normalt och slående hjärtan från hundratals zebrafisk embryon för att effektivt få hög kvalitet RNA-prover för vidare analyser. Den nuvarande metoden bygger på protokollet rapporterats av Burns och MacRae, 2006 8. För anrikning av hjärtvävnad, båda metoderna använder en transgen myocardial reporter linjeoch dra nytta av de olika vidhäftningsegenskaperna hos zebrafisk embryonala hjärtan kontra andra vävnader. I korthet, genom att pipettera många embryon upp och ned genom en smal pipettspets, hjärtan samtidigt frigörs från embryonala kroppar och därefter separeras från embryonala skräp i två snabba filtreringssteg; fluorescensmärkta hjärtan är sedan manuellt sorteras från återstående skräp och uppsamlas för ytterligare bearbetning.
Protocol
Representative Results
Discussion
Detta protokoll möjliggör snabb anrikning av zebrafisk embryonala hjärtvävnad för genuttryck analyser. Kvantitet och kvalitet av hjärtspecifika RNA-prov beror mycket på några avgörande steg: först, är den mängd av provet avsevärt förbättrade, om förlusten av hjärtan förhindras vid varje steg i protokollet, eftersom RNA rening endast fungerar med tillräcklig utgångsmaterial. För det andra, renheten av provet, som är helt beroende av försöksledaren, bestäms genom att sortera och samla hjärtan i p…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to thank C. Burns, C. McRae for outlining the basic principle of this purification protocol, and F. Priller for initial implementation of this method in our lab. S.A.-S. is supported by a Heisenberg professorship of the Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG). This work was supported by DFG grant SE2016/7-1.
Materials
| Equipment for raising fish and collecting eggs | see the Zebrafish Book11 for details | ||
| Fluorescence stereomicroscope | |||
| Refrigerated Microcentrifuge | |||
| UV-Spectrophotometer | eg. Thermo Scientific Nanodrop 2000 | ||
| Nucleic acid electrophoresis chamber | |||
| Petri dishes 4cm Ø, coated with 1% agarose in E3 medium | |||
| Micropipettes and tips (P20, P100, P1000) | |||
| 1,5ml centrifugation tubes | |||
| 15ml and 50ml centrifugation tubes | |||
| Pair of Dumont #5 forceps | |||
| ExactaCruz™ Round Gel Loading Tips in Sterile Rack, 1-200μl | Santa Cruz | sc-201732 | |
| 100 μm filter (BD Falcon 100 mm Cell Strainer) | BD Biosciences | 352360 | |
| 30 μm filter (Pre-Separation Filters-30 µm) | Miltenyi Biotec | 130-041-407 | |
| Phase lock gel, heavy, 1,5ml tubes | Prime | 2302810 | |
| Egg water medium | 60μg/ml Instant Ocean Sea Salts in ddH2O, 0.00001% (w/v) Methylene Blue | ||
| E3 medium | 5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4 | ||
| Tricaine (3-amino benzoic acidethylester) | Sigma-Aldrich | A-5040 | 4mg/ml Tricaine stock solution, pH 7 |
| 1% agarose (in E3 medium) | |||
| 1% agarose gel (in TBE buffer) | |||
| Leibovitz´s L-15 medium | Gibco | 21083-027 | |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | Sigma | F4135 | |
| RNAlater | Ambion | AM7020 | |
| Trizol | Ambion | 1559606 | |
| Glycogen | Invitrogen | 10814-010 | 20 µg/µL in RNase-free water |
| chloroform | |||
| isopropanol | |||
| 75% ethanol (in DEPC-ddH2O) | |||
| Nuclease-free water or sterilized DEPC treated ddH2O | |||
| Nucleic acid loading buffer | |||
| TBE (Tris/Borate/EDTA) buffer for electrophoresis |
References
- Stainier, D. Y., et al. Mutations affecting the formation and function of the cardiovascular system in the zebrafish embryo. Development. 123, 285-292 (1996).
- Chen, J. N., et al. Mutations affecting the cardiovascular system and other internal organs in zebrafish. Development. 123, 293-302 (1996).
- Bakkers, J. Zebrafish as a model to study cardiac development and human cardiac disease. Cardiovasc Res. 91, 279-288 (2011).
- Jowett, T., Lettice, L. Whole-mount in situ hybridizations on zebrafish embryos using a mixture of digoxigenin- and fluorescein-labelled probes. Trends Genet. 10, 73-74 (1994).
- Gibson, U. E., Heid, C. A., Williams, P. M. A novel method for real time quantitative RT-PCR. Genome Res. 6, 995-1001 (1996).
- Epstein, C. B., Butow, R. A. Microarray technology – enhanced versatility, persistent challenge. Curr Opin Biotechnol. 11, 36-41 (2000).
- Qian, X., Ba, Y., Zhuang, Q., Zhong, G. RNA-Seq Technology and Its Application in Fish Transcriptomics. OMICS. 18, 98-110 (2014).
- Burns, C. G., MacRae, C. A. Purification of hearts from zebrafish embryos. Biotechniques. 40, 274-278 (2006).
- Huang, C. J., Tu, C. T., Hsiao, C. D., Hsieh, F. J., Tsai, H. J. Germ-line transmission of a myocardium-specific GFP transgene reveals critical regulatory elements in the cardiac myosin light chain 2 promoter of zebrafish. Dev Dyn. 228, 30-40 (2003).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203, 253-310 (1995).
- Westerfield, M. . The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2000).
- Veerkamp, J., et al. Unilateral dampening of Bmp activity by nodal generates cardiac left-right asymmetry). Dev Cell. 24, 660-667 (2013).
- Jin, S. W., Beis, D., Mitchell, T., Chen, J. N., Stainier, D. Y. Cellular and molecular analyses of vascular tube and lumen formation in zebrafish. Development. 132, 5199-5209 (2005).
- Brownlie, A., et al. Characterization of embryonic globin genes of the zebrafish. Dev Biol. 255, 48-61 (2003).
- Marvin, M., et al. Developmental expression patterns of the zebrafish small heat shock proteins. Dev Dyn. 237, 454-463 (2008).
- Lam, C. S., Marz, M., Strahle, U. gfap and nestin reporter lines reveal characteristics of neural progenitors in the adult zebrafish brain. Dev Dyn. 238, 475-486 (2009).
- Wang, Y., et al. Moesin1 and Ve-cadherin are required in endothelial cells during in vivo tubulogenesis. Development. 137, 3119-3128 (2010).
- Heiman, M., et al. A translational profiling approach for the molecular characterization of CNS cell types. Cell. 135, 738-748 (2008).
- Tryon, R. C., Pisat, N., Johnson, S. L., Dougherty, J. D. Development of translating ribosome affinity purification for zebrafish. Genesis. 51, 187-192 (2013).
