عزل Potentiated Hsp104 المتغيرات عن طريق الخميرة Proteinopathy نماذج
Summary
Yeast proteinopathy models are valuable tools to assess the toxicity and aggregation of proteins implicated in disease. Here, we present methods for screening Hsp104 variant libraries for toxicity suppressors. This protocol could be adapted to screen any protein library for toxicity suppressors of any protein that is toxic in yeast.
Abstract
Many protein-misfolding disorders can be modeled in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Proteins such as TDP-43 and FUS, implicated in amyotrophic lateral sclerosis, and α-synuclein, implicated in Parkinson’s disease, are toxic and form cytoplasmic aggregates in yeast. These features recapitulate protein pathologies observed in patients with these disorders. Thus, yeast are an ideal platform for isolating toxicity suppressors from libraries of protein variants. We are interested in applying protein disaggregases to eliminate misfolded toxic protein conformers. Specifically, we are engineering Hsp104, a hexameric AAA+ protein from yeast that is uniquely capable of solubilizing both disordered aggregates and amyloid and returning the proteins to their native conformations. While Hsp104 is highly conserved in eukaryotes and eubacteria, it has no known metazoan homologue. Hsp104 has only limited ability to eliminate disordered aggregates and amyloid fibers implicated in human disease. Thus, we aim to engineer Hsp104 variants to reverse the protein misfolding implicated in neurodegenerative disorders. We have developed methods to screen large libraries of Hsp104 variants for suppression of proteotoxicity in yeast. As yeast are prone to spontaneous nonspecific suppression of toxicity, a two-step screening process has been developed to eliminate false positives. Using these methods, we have identified a series of potentiated Hsp104 variants that potently suppress the toxicity and aggregation of TDP-43, FUS, and α-synuclein. Here, we describe this optimized protocol, which could be adapted to screen libraries constructed using any protein backbone for suppression of toxicity of any protein that is toxic in yeast.
Introduction
وقد تم تطوير نماذج proteinopathy الخميرة للاضطرابات misfolding البروتين بما في ذلك التصلب الضموري الجانبي (ALS) ومرض باركنسون (PD) 1-3. التعبير عن البروتينات TDP-43 والفتح الرباطي، الذي misfold في مرضى ALS، هي سامة وmislocalize لتشكيل المجاميع حشوية في الخميرة 1،2. وبالمثل، فإن التعبير عن α-synuclein (α-SYN)، والذي تورط في PD، غير سامة وmislocalizes لتشكيل المجاميع حشوية في الخميرة 3. هذه الميزات ألخص الظواهر في المرضى الذين يعانون من هذه الاضطرابات 4،5. وبالتالي، نماذج الخميرة توفر منبرا مفيدا لفحص للبروتينات أو الجزيئات الصغيرة التي منع أو عكس هذه الظواهر 2،6-13. ونحن مهتمون في تطوير بروتينات قادرة على عكس التجميع وسمية بسبب TDP-43، الفتح، وα-SYN. ونحن نركز على Hsp104، وهو AAA + البروتين من الخميرة قادرة فريد من تجزئة البروتينات سواء الابالمجاميع غير متبلور أوم واميلويد في الخميرة، إلا أنه لا يوجد لديه نديد البشري 14،15. يتم ضبطها بدقة Hsp104 إلى تفصيل البريونات الخميرة الذاتية وليس لديها سوى قدرة محدودة على تفصيل ركائز المتورطين في أمراض الاعصاب الإنسان، وهو ما لم يصادف عادة 16،17. وبالتالي، فإننا نهدف إلى مهندس إصدارات محسنة من Hsp104 التي تكون قادرة على تفصيل هذه ركائز الإنسان بشكل فعال. للقيام بذلك، ونحن بناء مكتبات كبيرة من Hsp104 المتغيرات باستخدام عرضة للخطأ PCR. هذه المكتبات يمكن عرضه باستخدام نماذج الخميرة proteinopathy 17. اعتمدنا نهجا المستهدفة المجال إلى بناء وفحص والمكتبات، كما Hsp104 هي كبيرة جدا 17. ركزنا في البداية على المجال المتوسط (MD) من Hsp104 17، على الرغم من نهج مماثلة يمكن استخدامها لفحص المجالات الأخرى. هذه النماذج تمكين الكشف عن النشاط disaggregase مباشرة، بدلا من تقنيات بديلة مثل سطح الشاشة، والتي هي بقيةricted لاستخدامها لمراقبة ملزمة 18.
ويستند بروتوكول لدينا على خطوتين الفرز (الشكل 1). أولا، يتم اختيار المتغيرات Hsp104 التي تقمع سمية الركيزة المرض في الخميرة. للقيام بذلك، وHsp104 المتغيرات وcotransformed من الأمراض المرتبطة الركيزة في Δ hsp104 الخميرة. نحن توظيف Δ hsp104 الخميرة لاستكشاف الفضاء تسلسل Hsp104 في غياب البرية من نوع (WT) Hsp104 17. الأهم من ذلك، حذف Hsp104 لا يؤثر α-SYN، الفتح، أو TDP-43 سمية في الخميرة، والتعبير عن Hsp104 WT يوفر الحد الأدنى الإنقاذ 1،13،17. ثم يتم مطلي الخميرة على حمل وسائل الإعلام للحث على التعبير عن كل من البروتينات. الخميرة إيواء Hsp104 المتغيرات التي تقمع سمية النمو الركيزة تتداول المرتبط المرض للمستعمرة. ويتم اختيار هذه المتغيرات لمزيد من التحليل، في حين أن المستعمرات الحفاظ على المتغيرات التي لا قمع سمية يموت. ومع ذلك،ايجابيات كاذبة هي مشكلة كبيرة في هذه الشاشة. التعبير عن TDP-43، الفتح، وα-SYN شديدة السمية، مما يخلق ضغط انتقائي قوي لظهور المكثفات الوراثية عفوية سمية لا علاقة لها البديل Hsp104 يجري التعبير عنها. وبالتالي، فإننا قد استخدمت شاشة الثانوية التي هي أيضا إنتاجية عالية نسبيا للقضاء على هذه المكثفات سمية غير محددة 17. في هذه الشاشة الثانوية، ويتم التعامل مع الخميرة اختيار 5-Fluorootic حمض (5 FOA) لمواجهة حدد لالبلازميد Hsp104 19. ثم يتم تقييم السلالات لالركيزة (TDP-43، الفتح، أو α-SYN) سمية عن طريق اكتشاف فحص للتأكد من أن يتم استعادة سمية الركيزة بعد فقدان البلازميد Hsp104. وبالتالي، الخميرة التي يتم استعادة سمية في هذه شاشة عرض ثانوية يفترض أصلا سمية قمع بسبب وجود البديل Hsp104. وتتم تسمية هذه الخميرة باسم 'يضرب' ويجب أن يكون البلازميد ثم Hsp104تعافى والتسلسل لتحديد الطفرات في الجين Hsp104 17 (الشكل 1). وينبغي بعد ذلك إعادة تأكيد أي إصابات عن طريق بناء الطفرة بشكل مستقل باستخدام الطفرات موقع الموجه ثم إعادة الاختبار لقمع سمية. التطبيقات المحتملة لهذا البروتوكول واسعة. باستخدام هذه الأساليب، يمكن فرزهم المكتبات من أي نوع من البروتين للمتغيرات التي تقمع سمية من أي بروتين الركيزة التي هي سامة في الخميرة.
Protocol
Representative Results
Discussion
هنا نقدم نهجنا لعزل potentiated Hsp104 المتغيرات التي تقمع سمية ركائز المرتبط المرض باستخدام نماذج الخميرة proteinopathy. باستخدام هذا النهج، مكتبات كبيرة من المتغيرات يمكن عرضه في إنتاجية عالية، والحد الوحيد هو في عدد من المتغيرات التي تمر على الشاشة الثانوية 5-FOA. قبل تنفيذ هذه ا?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Sue Lindquist, Aaron Gitler, and Martin Duennwald for kindly sharing reagents. Our studies were supported by: an American Heart Association Post-Doctoral Fellowship (M.E.J); NIH Director’s New Innovator Award DP2OD002177, NIH grants R21NS067354, R21HD074510, and R01GM099836, a Muscular Dystrophy Association Research Award (MDA277268), Packard Center for ALS Research at Johns Hopkins University, Target ALS, and an Ellison Medical Foundation New Scholar in Aging Award (J.S.).
Materials
| Table of Specific Materials/Equipment | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| GeneMorphII EZClone Domain Mutagenesis Kit | Agilent | 200552 | |
| 150mm Petri dishes | Falcon | 351058 | |
| 5-Fluorootic Acid | Research Products International | f10501-5.0 | |
| 96-DeepWell 2mL Plates | Eppendorf | 0030 502.302 | |
| 96 bold replicator tool | V&P Scientific | vp-404 | |
| ExoSAP-IT | Affymetrix | 78200 |
References
- Johnson, B. S., McCaffery, J. M., Lindquist, S., Gitler, A. D. A yeast TDP-43 proteinopathy model: Exploring the molecular determinants of TDP-43 aggregation and cellular toxicity. Proc Natl Acad Sci USA. 105 (17), 6439-6444 (2008).
- Sun, Z., et al. Molecular Determinants and Genetic Modifiers of Aggregation and Toxicity for the ALS Disease Protein FUS/TLS. PLoS Biol. 9 (4), (2011).
- Outeiro, T. F., Lindquist, S. Yeast Cells Provide Insight into Alpha-Synuclein Biology and Pathobiology. Science. 302 (5651), 1772-1775 (2003).
- Forman, M. S., Trojanowski, J. Q., Lee, V. M. Neurodegenerative diseases: a decade of discoveries paves the way for therapeutic breakthroughs. Nat Med. 10 (10), 1055-1063 (2004).
- Morimoto, R. I. Stress, aging, and neurodegenerative disease. N Engl J Med. 355 (21), 2254-2255 (2006).
- Elden, A. C., et al. Ataxin-2 intermediate-length polyglutamine expansions are associated with increased risk for ALS. Nature. 466 (7310), 1069-1075 (2010).
- Cooper, A. A., et al. Alpha-synuclein blocks ER-Golgi traffic and Rab1 rescues neuron loss in Parkinson’s models. Science. 313 (5785), 324-328 (2006).
- Gitler, A. D., et al. Alpha-synuclein is part of a diverse and highly conserved interaction network that includes PARK9 and manganese toxicity. Nature genetics. 41 (3), 308-315 (2009).
- Su, L. J., et al. Compounds from an unbiased chemical screen reverse both ER-to-Golgi trafficking defects and mitochondrial dysfunction in Parkinson’s disease models. Disease models & mechanisms. (3-4), 194-208 (2010).
- Tardiff, D. F., et al. Yeast reveal a ‘druggable’ Rsp5/Nedd4 network that ameliorates alpha-synuclein toxicity in neurons. Science. 342 (6161), 979-983 (2013).
- Tardiff, D. F., Tucci, M. L., Caldwell, K. A., Caldwell, G. A., Lindquist, S. Different 8-hydroxyquinolines protect models of TDP-43 protein, alpha-synuclein, and polyglutamine proteotoxicity through distinct mechanisms. The Journal of biological chemistry. 287 (6), 4107-4120 (2012).
- Kim, H. J., et al. Therapeutic modulation of eIF2alpha phosphorylation rescues TDP-43 toxicity in amyotrophic lateral sclerosis disease models. Nature. 46 (2), 152-160 (2014).
- Ju, S., et al. A yeast model of FUS/TLS-dependent cytotoxicity. PLoS Biol. 9 (4), (2011).
- Shorter, J. Hsp104: a weapon to combat diverse neurodegenerative disorders. Neurosignals. 16 (1), 63-74 (2008).
- Vashist, S., Cushman, M., Shorter, J. Applying Hsp104 to protein-misfolding disorders. Biochem Cell Biol. 88 (1), 1-13 (2010).
- DeSantis, M. E., et al. Operational Plasticity Enables Hsp104 to Disaggregate Diverse Amyloid and Nonamyloid Clients. Cell. 151 (4), 778-793 (2012).
- Jackrel, M. E., et al. Potentiated Hsp104 Variants Antagonize Diverse Proteotoxic Misfolding Events. Cell. 156 (1-2), 170-182 (2014).
- Wittrup, K. D., Verdine, G. L., Wittrup, K. D., Verdine, G. L. . Methods in Enzymology. 503, 13-14 (2012).
- Boeke, J. D., Trueheart, J., Natsoulis, G., Fink, G. R. . Methods in Enzymology. 154, 164-175 (1987).
- Miyazaki, K. Creating Random Mutagenesis Libraries by Megaprimer PCR of Whole Plasmid (MEGAWHOP). Directed Evolution Library Creation: Methods in Molecular Biology. eds FrancesH Arnold & George Georgiou. 231, 23-28 (2003).
- Saibil, H. Chaperone machines for protein folding, unfolding and disaggregation. Nat Rev Mol Cell Biol. 14 (10), 630-642 (2013).
- Gietz, R. D., Schiestl, R. H. High-efficiency yeast transformation using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method. Nat. Protocols. 2 (1), 31-34 (2007).
- Armakola, M., Hart, M. P., Gitler, A. D. TDP-43 toxicity in yeast. Methods. 53 (3), 238-245 (2011).
- Alberti, S., Gitler, A. D., Lindquist, S. A suite of Gateway® cloning vectors for high-throughput genetic analysis in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 24 (10), 913-919 (2007).
