Isolerende potenseret Hsp104 Varianter med Gær Proteinopathy Modeller

Summary

Yeast proteinopathy models are valuable tools to assess the toxicity and aggregation of proteins implicated in disease. Here, we present methods for screening Hsp104 variant libraries for toxicity suppressors. This protocol could be adapted to screen any protein library for toxicity suppressors of any protein that is toxic in yeast.

Abstract

Many protein-misfolding disorders can be modeled in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Proteins such as TDP-43 and FUS, implicated in amyotrophic lateral sclerosis, and α-synuclein, implicated in Parkinson’s disease, are toxic and form cytoplasmic aggregates in yeast. These features recapitulate protein pathologies observed in patients with these disorders. Thus, yeast are an ideal platform for isolating toxicity suppressors from libraries of protein variants. We are interested in applying protein disaggregases to eliminate misfolded toxic protein conformers. Specifically, we are engineering Hsp104, a hexameric AAA+ protein from yeast that is uniquely capable of solubilizing both disordered aggregates and amyloid and returning the proteins to their native conformations. While Hsp104 is highly conserved in eukaryotes and eubacteria, it has no known metazoan homologue. Hsp104 has only limited ability to eliminate disordered aggregates and amyloid fibers implicated in human disease. Thus, we aim to engineer Hsp104 variants to reverse the protein misfolding implicated in neurodegenerative disorders. We have developed methods to screen large libraries of Hsp104 variants for suppression of proteotoxicity in yeast. As yeast are prone to spontaneous nonspecific suppression of toxicity, a two-step screening process has been developed to eliminate false positives. Using these methods, we have identified a series of potentiated Hsp104 variants that potently suppress the toxicity and aggregation of TDP-43, FUS, and α-synuclein. Here, we describe this optimized protocol, which could be adapted to screen libraries constructed using any protein backbone for suppression of toxicity of any protein that is toxic in yeast.

Introduction

Der er blevet udviklet gær proteinopathy modeller for protein-misfoldning lidelser, herunder amyotrofisk lateral sklerose (ALS) og Parkinsons sygdom (PD) ^1-3. Ekspressionen af proteinerne TDP-43 og FUS, som fejlfolde i ALS-patienter, er giftige og mislocalize til dannelse af cytoplasmiske aggregater i gær ^1,2. Tilsvarende ekspression af α-synuclein (α-syn), som er impliceret i PD, er giftigt og mislocalizes til dannelse af cytoplasmiske aggregater i gær ^3. Disse funktioner rekapitulere fænotyper hos patienter med disse lidelser ^4,5. Således gær modeller giver en nyttig platform for screening for proteiner eller små molekyler, forebygge eller reversere disse fænotyper ^2,6-13. Vi er interesseret i udvikling af proteiner, som er i stand til at vende aggregering og toksicitet på grund af TDP-43, FUS og α-syn. Vi fokuserer på Hsp104, en AAA + protein fra gær, der er entydigt stand disaggregere proteiner både frOM amorfe aggregater og amyloid i gær, men det har ingen menneskelig homolog ^14,15. Hsp104 er fintunet til disaggregere endogene gær prioner og har kun begrænset mulighed for at disaggregere substrater impliceret i humane neurodegenerative sygdomme, som den aldrig normalt møder ^16,17. Derfor tilstræber vi at konstruere forbedrede versioner af Hsp104 der er i stand til efficaciously disaggregere disse menneskelige substrater. At gøre det, vi konstruere store biblioteker af Hsp104 varianter hjælp fejltilbøjelig PCR; disse biblioteker kan screenes ved hjælp af gær proteinopathy modeller ^17. Vi har vedtaget et domæne målrettet tilgang til at konstruere og screening af biblioteker, som Hsp104 er meget stor ^17. Vi oprindeligt fokuserede på den midterste domæne (MD) i Hsp104 ^17, selv om lignende tiltag kan anvendes til at screene andre domæner. Disse modeller muliggør screening for disaggregase aktivitet direkte i modsætning til alternative teknikker, såsom overflade display, som er hvilericted at bruge til overvågning af binding ^18.

Vores protokol er baseret på to screening trin (figur 1). Først Hsp104 varianter, der undertrykker toksicitet af sygdommen substrat i gær valgt. For at gøre dette, det Hsp104 varianter og sygdom-associeret substrat cotransformeres i Δ hsp104 gær. Vi beskæftiger Δ hsp104 gær at udforske Hsp104 sekvens plads i fravær af vildtype (WT) Hsp104 ^17. Vigtigere, er sletning af Hsp104 ikke påvirke α-syn, FUS eller TDP-43 toksicitet i gær, og ekspressionen af Hsp104 ^WT giver minimal redning ^1,13,17. Gæren udplades derefter på inducerende medier at inducere ekspression af begge proteiner. Gær huser Hsp104 varianter, der undertrykker toksicitet af sygdommen associeret substrat tillægger vækst af kolonien. Disse varianter er udvalgt til yderligere analyse, mens kolonier opretholde varianter, der ikke undertrykker toksicitet dø. Menfalske positiver er et væsentligt problem i denne skærm. Ekspression af TDP-43, FUS og α-syn er meget giftige, hvilket skaber et stærkt selektivt tryk for fremkomsten af ​​spontane genetiske suppressorer af toksicitet relateret til Hsp104 variant, der udtrykkes. Således har vi anvendt en sekundær skærm, er også relativt højt gennemløb for at fjerne disse uspecifikke toksicitet suppressorer ^17. I denne sekundære skærm er valgt gær behandlet med 5-Fluorootic Acid (5-FOA) for at imødegå vælge for Hsp104 plasmidet ^19. Stammerne vurderes derefter for substrat (TDP-43, FUS eller α-syn) toksicitet via spotting assay for at sikre, at toksiciteten af ​​substratet er genoprettet efter tab af Hsp104 plasmid. Således, gær, hvor toksicitet er genoprettet i denne sekundære skærm formentlig oprindeligt viste toksicitet undertrykkelse på grund af tilstedeværelsen af ​​Hsp104 variant. Disse gær betegnes som »hits« og Hsp104 plasmidet skal da væreudvindes og sekventeret for at identificere mutationerne i Hsp104-gen ¹⁷ (figur 1). Nogen hits skal derefter bekræftes af konstruere mutationen selvstændigt anvendelse af site-directed mutagenese og derefter gentest for toksicitet undertrykkelse. De potentielle anvendelsesmuligheder for denne protokol er brede. Ved hjælp af disse metoder, kan biblioteker af enhver type protein screenes for varianter, der undertrykker toksicitet helst substrat protein, som er toksisk i gær.

Protocol

1. Bibliotek Generation At konstruere biblioteker af Hsp104 bruger Domain-specifikke fejlbehæftet PCR, først forstærke domæne af interesse med en fejl tilbøjelige DNA-polymerase 20. Oprense PCR-produktet ved gel ekstraktion. Udfør en megaprimer udvidelse trin ved anvendelse af en standard site-directed mutagenese protokol: kombinere 50 ng template plasmid, 250 ng megaprimer, 200 uM dNTP'er, og high-fidelity DNA-polymerase i PCR-buffer og fortyndes til 50 ul totalvolume…

Representative Results

Vi har konstrueret et bibliotek af Hsp104 varianter randomiseret i midten domæne og screenet det til undertrykkelse af TDP-43 toksicitet. Biblioteket blev transformeret og udpladet på glucose og galactose plader (figur 2) at vurdere stringensen af skærmen. Enkelte kolonier blev udvalgt og stammerne counter udvalgt under anvendelse af 5-FOA at fjerne Hsp104 plasmid. Disse stammer blev derefter vurderet til at bekræfte, at toksicitet skyldes TDP-43 alene uden Hsp104 varianter. Spotting assays af en de…

Discussion

Her præsenterer vi vores tilgang til at isolere potentierede Hsp104 varianter, der undertrykker toksicitet sygdomsassocierede substrater ved hjælp af gær proteinopathy modeller. Med denne fremgangsmåde kan store biblioteker af varianter screenes i high throughput, med den eneste begrænsning er antallet af varianter, der passerer 5-FOA sekundær skærm. Ved at udføre disse trin i 96-brønds format, vi rutinemæssigt screene op til 200 hits på et tidspunkt i 5-FOA trin i løbet af 1-2 uger. Antallet af hits opnået…

Materials

Table of Specific Materials/Equipment
Name	Company	Catalog Number	Comments
GeneMorphII EZClone Domain Mutagenesis Kit	Agilent	200552
150mm Petri dishes	Falcon	351058
5-Fluorootic Acid	Research Products International	f10501-5.0
96-DeepWell 2mL Plates	Eppendorf	0030 502.302
96 bold replicator tool	V&P Scientific	vp-404
ExoSAP-IT	Affymetrix	78200