ペプチド配列の使用タンパク質間相互作用部位を同定
Summary
Peptide array screening is a high throughput assay for identifying protein-protein interaction sites. This allows mapping multiple interactions of a target protein and can serve as a method for identifying sites for inhibitors that target a protein. Here we describe a protocol for screening and analyzing peptide arrays.
Abstract
タンパク質 – タンパク質相互作用は、生物の生きている細胞および対照恒常性プロセスの大部分を媒介する。損なわれたタンパク質相互作用は、タンパク質相互作用に重要な薬剤標的を作る疾患をもたらし得る。これは、分子レベルでこれらの相互作用を理解することが非常に重要である。タンパク質相互作用は、細胞性及び生化学的アッセイから定量的な生物物理学的アッセイの範囲の様々な技術を用いて研究されており、これらは、タンパク質ドメイン、またはペプチドと、全長タンパク質のいずれかで実施することができる。ペプチドは、ペプチドを容易に合成することができるので、タンパク質相互作用を研究し、特定の相互作用部位に焦点を可能にするための優れたツールを提供。ペプチドアレイは、2つのタンパク質間の相互作用部位の同定、ならびに治療目的のために、標的タンパク質に結合するペプチドのスクリーニングを可能にする。彼らはまた、高スループットのSAR研究を可能にします。結合部位の同定のため、typi校正ペプチドアレイは、通常、部分的に、所望の標的タンパク質の1つまたは複数のパートナータンパク質の完全な配列に由来する10〜20残基の重複ペプチドが含まれています。標的タンパク質を結合するためのアレイをスクリーニングするタンパク質の少量のみを使用して簡単かつ迅速な方法では、パートナータンパク質における結合部位に対応し、結合ペプチドを明らかにする。
この記事では、標的タンパク質とそのパートナーの間の相互作用部位をマッピングするためのペプチド配列をスクリーニングするためのプロトコルを記述します。ペプチドアレイを考慮し、それらの二次構造をとるパートナータンパク質の配列に基づいて設計されている。このプロトコルで使用されるアレイは、INTAVISバイオ分析·インスツルメンツによって調製しCelluspots配列だった。アレイは、非特異的結合した後、勉強タンパク質とインキュベートを防ぐためにブロックされます。抗体を用いた検出は、タンパク質間の特定の相互作用部位に対応する結合ペプチドを明らかにする。
Introduction
タンパク質 – タンパク質相互作用は、生細胞内のプロセスの大部分を媒介する。損なわれたタンパク質相互作用は、タンパク質相互作用に重要な薬剤標的を作る疾患をもたらし得る。これは、分子レベルでこれらの相互作用を理解することが非常に重要である。タンパク質相互作用は、細胞性及び生化学的アッセイから定量的な生物物理学的アッセイの範囲の様々な技術を用いて研究されており、これらは、タンパク質ドメイン、またはペプチドと、全長タンパク質のいずれかで実施することができる。ペプチドは、タンパク質相互作用を研究するための優れたツールとして役立つ。ペプチドは容易に合成され、一方、他方の1,2-高スループット様式での複数のタンパク質標的上の特定の相互作用部位に焦点を可能にすることができるからである。ペプチドアレイスクリーニングは、短時間3に多数のパートナーと標的タンパク質との相互作用に関する大量のデータを得るための方法を実行するのは簡単、高速で。タンパク質 – タンパク質相互作用を検出し、分析するための他の生化学的または生物物理学的方法とは異なり、ペプチドアレイスクリーニングは、タンパク質の非常に低い濃度を必要とし、非常に弱い結合を検出することができる。ペプチド配列は、酵素活性6と高スループットを研究する抗体エピトープ5を特徴付ける、そのようなタンパク質-タンパク質または受容体-リガンド相互作用部位4、ホモまたはヘテロオリゴマー化インターフェースのマッピングのようなペプチド-タンパク質相互作用の多くの用途に使用することができる構造-活性関係（SAR）は7を研究。ペプチドアレイのスクリーニングについての詳細なレビューについてはカッツらを参照してください。4
ペプチドアレイのいくつかのタイプは、現在存在している。固体支持体にそれらを取り付ける前に、ペプチドの合成、または固体支持体上に直接ペプチドの合成は主に、SPOT技術の4,8を使用して、：ペプチドアレイを作製するための2つの主要な合成戦略があります。ザ·ペプチドは、9-フルオレニルメチルオキシカルボニル（Fmoc）化学8、通常、固体支持体上で合成される。一般的な合成スキームの中でC末端を介してペプチドのN末端 を介してアタッチメント（ 例えば、JPTのpepstarアレイ9）およびペプチドアタッチメントがある（ 例えば、PEPSCANのpepchipアレイ10、JPTのペプスポットアレイ9とINTAVISのcelluspotアレイ11）4。固体支持体は変わるので、それへのペプチド結合の化学を行いますことができます。システイン-末端ペプチドは、チオール基12を介してスライドガラスに付着させることができる。ペプチドのN末端 に共有結合したアミノ酸のエステル化セルロース膜上のヒドロキシル基に結合することができる8を取り付け。
ここでは、タンパク質 – タンパク質相互作用を研究するための方法として、ペプチドアレイをスクリーニングするための詳細なプロトコールを提示する。私たちが使用する配列は、大規模なAMOを含むマイクロアレイであるCelluspots配列ですスライドガラスでサポートされている小さなセルロース膜上にスポット（最大384スポットの重複）のUNT。これは、低タンパク質のボリュームと抗体と協力し、一回の実験あたりのデータのかなりの量を得ることができます。この配列はまた、低親和性結合の検出を可能にする高いペプチド密度が含まれています。アレイは、正常な細胞増殖13を制御するために非常に重要であるSTIL、CHFRの相互作用をマッピングするために使用した。 2つのタンパク質間の制御されない相互作用が癌の発生につながる可能性がある。この相互作用をマッピングすることによって、私たちは、特定の結合部位を発見し、残基14を結合。これは、このタンパク質 – タンパク質相互作用を阻害する阻害剤の合理的設計のための道を開く。
Protocol
Representative Results
Discussion
ペプチドアレイスクリーニングは、そのパートナーで標的タンパク質の結合部位を同定するための優れたツールである。このアッセイは、実行するために迅速かつ容易であり、結果は、1つまたは2つの営業日で得ることができる。ペプチドアレイスクリーニングは汎用性があり、多くの目的に使用することができる。これは、リン酸化などの翻訳後の修飾を特徴付けるし、キナーゼの基質を?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
AFは欧州共同体の第7次フレームワーク·プログラムの下での欧州研究評議会から始まる助成金によってサポートされていました（FP7 / 2007年から2013年）/ ERCグラント契約がn 203413を°、複雑なsystems.HAバイオハイブリッドとAIのためのミネルヴァセンターがサポートされていますダリアとダン·メイダンフェローシップによるエルサレムのヘブライ大学で高度な学位学生のため。
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Peptide array | INTAVIS Bioanalytical Instruments | ||
| His-probe Antibody (H-3) HRP | Santa Cruz Biotechnology | sc-8036 HRP | |
| EZ-ECL Kit | Biological industries | 20-500-120 | |
| Skim Milk | Becton, Dickinson and Company | 232100 | |
| LAS-3000 camera | FUJI film |
References
- Benyamini, H., Friedler, A. Using peptides to study protein–protein interactions. Future Medicinal Chemistry. 2 (6), 989-1003 (2010).
- Geysen, H. M., Wagner, C. D. Isotope or mass encoding of combinatorial libraries. Chemistry & Biology. 3 (8), 679-688 (1996).
- Frank, R. Spot-synthesis: an easy technique for the positionally addressable, parallel chemical synthesis on a membrane support. Tetrahedron. 48 (42), 9217-9232 (1992).
- Katz, C., Levy-Beladev, L., Rotem-Bamberger, S., Rito, T., Rudiger, S. G., Friedler, A. Studying protein-protein interactions using peptide arrays. Chem Soc Rev. 40 (5), 2131-2145 (2011).
- Hansen, L. B., Buus, S., Schafer-Nielsen, C. Identification and Mapping of Linear Antibody Epitopes in Human Serum Albumin Using High-Density Peptide Arrays. PLoS ONE. 8 (7), (2013).
- Uecker, A. A substrate peptide for the FLT3 receptor tyrosine kinase. British Journal of Haematology. 144 (1), 127-130 (2009).
- Gabizon, R., Faust, O., Benyamini, H., Nir, S., Loyter, A., Friedler, A. Structure-activity relationship studies using peptide arrays: the example of HIV-1 Rev-integrase interaction. Med. Chem. Commun. 4 (1), 252-259 (2013).
- Frank, R. The SPOT-synthesis technique: Synthetic peptide arrays on membrane supports—principles and applications. Journal of Immunological Methods. 267 (1), 13-26 (2002).
- Falsey, J. R., Renil, M., Park, S., Li, S., Lam, K. S. Peptide and Small Molecule Microarray for High Throughput Cell Adhesion and Functional Assays. Bioconjugate Chemistry. 12 (3), 346-353 (2001).
- Castiel, A., Danieli, M. M. The Stil protein regulates centrosome integrity and mitosis through suppression of Chfr. Journal of Cell Science. 124 (4), 532-539 (2011).
- Amartely, H., David, A., Lebendiker, M., Benyamini, H., Izraeli, S., Friedler, A. The STIL protein contains intrinsically disordered regions that mediate its protein-protein interactions. Chemical Communications. 50, 5245-5247 (2013).
- Izraeli, S., Lowe, L. A. The SIL gene is required for mouse embryonic axial development and left-right specification. Nature. 399 (6737), 691-694 (1999).
- Izraeli, S., Colaizzo-Anas, T., Bertness, V. L., Mani, K., Aplan, P. D., Kirsch, I. R. Expression of the SIL gene is correlated with growth induction and cellular proliferation. Cell Growth Differ. 8 (11), 1171-1179 (1997).
- Arquint, C., Sonnen, K. F., Stierhof, Y. -. D., Nigg, E. a Cell-cycle-regulated expression of STIL controls centriole number in human cells. Journal of Cell Science. 125 (5), 1342-1352 (2012).
- Tang, C. J., Lin, S. Y. The human microcephaly protein STIL interacts with CPAP and is required for procentriole formation. Embo J. 30 (23), 4790-4804 (2011).
- Vulprecht, J., David, A. STIL is required for centriole duplication in human cells. Journal of Cell Science. 125 (5), 1353-1362 (2012).
- Campaner, S., Kaldis, P., Izraeli, S., Kirsch, I. R. Sil phosphorylation in a Pin1 binding domain affects the duration of the spindle checkpoint. Mol Cell Biol. 25 (15), 6660-6672 (2005).
- Kasai, K., Inaguma, S., Yoneyama, A., Yoshikawa, K., Ikeda, H. SCL/TAL1 interrupting locus derepresses GLI1 from the negative control of suppressor-of-fused in pancreatic cancer cell. Cancer Res. 68 (19), 7723-7729 (2008).
- Chaturvedi, P., Sudakin, V. Chfr regulates a mitotic stress pathway through its RING-finger domain with ubiquitin ligase activity. Cancer Res. 62 (6), 1797-1801 (2002).
- Olaussen, K. a., Commo, F. Synergistic proapoptotic effects of the two tyrosine kinase inhibitors pazopanib and lapatinib on multiple carcinoma cell lines. Oncogene. 28 (48), 4249-4260 (2009).
- Reingewertz, T. H., Britan-Rosich, E. Mapping the Vif–A3G interaction using peptide arrays: A basis for anti-HIV lead peptides. Bioorganic & Medicinal Chemistry. 21 (12), 3523-3532 (2013).
- Katz, C., Benyamini, H. Molecular basis of the interaction between the antiapoptotic Bcl-2 family proteins and the proapoptotic protein ASPP2. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (34), 12277-12282 (2008).
- Katz, C., Zaltsman-Amir, Y., Mostizky, Y., Kollet, N., Gross, A., Friedler, A. Molecular Basis of the Interaction between Proapoptotic Truncated BID (tBID) Protein and Mitochondrial Carrier Homologue 2 (MTCH2) Protein: KEY PLAYERS IN MITOCHONDRIAL DEATH PATHWAY. Journal of Biological Chemistry. 287 (18), 15016-15023 (2012).
- Rosenberg, M. M., Ronen, D., Lahav, N., Nazirov, E., Ravid, S., Friedler, A. High resolution characterization of myosin IIC tailpiece and its effect on filament assembly. Journal of Biological Chemistry. 288 (14), 9779-9789 (2013).
