The advancement of western blotting using fluorescence has allowed detection of subtle changes in protein expression enabling quantitative analyses. Here we describe a robust methodology for detection of a range of proteins across a variety of species and tissue types. A strategy to overcome common technical problems is also provided.
På slutten av 1970-tallet kom de første offentlig rapportert bruk av western blot, en teknikk for å vurdere tilstedeværelse og relative overflod av spesifikke proteiner i komplekse biologiske prøver. Siden da, har western blotting metodikk blitt en vanlig komponent i molekylærbiologer eksperimentelle repertoar. En overfladisk søk i PubMed å bruke begrepet "western blot" antyder at i overkant av 220 000 publiserte manuskripter har gjort bruk av denne teknikken innen år 2014. Viktigere, har de siste ti årene sett teknisk bildebehandling fremskritt kombinert med utviklingen av sensitive fluorescerende etiketter som har forbedret sensitivitet og overgitt enda større områder av lineær gjenkjenning. Resultatet er en nå virkelig kvantifiserbar fluorescens basert Western Blot (QFWB) som tillater komparativ uttrykk analyse biologer å gjennomføre med større følsomhet og nøyaktighet enn noen gang før. Mange "optimalisert" western blottingmetoder finnes og benyttes i forskjellige laboratorier. Disse viser seg ofte vanskelig å gjennomføre på grunn av kravet om subtile, men udokumenterte prosessuelle endringer. Denne protokollen gir en omfattende beskrivelse av en etablert og robust QFWB metoden, komplett med feilsøkingsstrategier.
Western-blotting (WB) er en analytisk teknikk som opprinnelig ble utviklet på slutten av 1970-årene for å bestemme nærvær eller fravær av et protein av interesse i et komplekst biologisk prøve, slik som en vev homogenat 1. Ofte referert til som protein immunoblot, på grunn av nøkkelen antistoff-antigen-interaksjon, består metodikken av 5 adskilte trinn: 1) elektroforetisk separering av proteinene ved deres isoelektriske punkt; 2) overføring til en nitrocellulose eller polyvinylidendifluorid (PVDF) membran; 3) merking ved bruk av et primært antistoff som er spesifikt til proteinet av interesse; 4) inkubasjon med et sekundært antistoff rettet mot det primære antistoff; og 5) visualisering.
Visualisering metodikken har utviklet seg med tiden til å forbedre sikkerheten og følsomhet. Noen av de første BAC ble utført ved hjelp av radiomerkede koder som deretter utviklet seg til kolo og deretter de mer utbredt chemilluminescent (ECL) metoder. Radioaktivitetenty ble direkte merket på prober for spesifikke antigener, mens kolorimetriske metoder og ECL bruke en indirekte teknikk for merking med et enzym reporter for eksempel alkalisk fosfatase eller streptavidin-pepperrot peroksydase (HRP) 2. Intensiteten av merking av chromagen eller luminescent produkt blir målt ved hjelp av densitometri hvorved signalstyrken, sterk eller svak, mer eller mindre indikerer nærværet av proteinet av interesse i prøven. ECL er mer følsom og derfor foretrekkes metodikk 2, men alle tre metoder ble opprinnelig utviklet på røntgenfilm med mer sofistikerte digital avbildningsteknikker deretter etablert tre. Fremme av digital avbildning av WB ikke bare tillot en forsker for å bestemme nærvær eller fravær av deres protein av interesse, men også tillatt en slutning til nivået av ekspresjon av et valgt protein når sammenlignet mot andre prøver, og kan derfor bli henvist til som "semi-kvantitativ & #8221 ;. Nylig har en virkelig kvantitativt og mer følsom western-blotting-teknologi blitt utviklet hvorved nivået av fluorescens målt er direkte relatert til mengden og ekspresjon av et enkelt protein i en prøve: kvantitativt fluorescerende western blotting (QFWB).
Når man sammenligner QFWB med ECL merking, bruk av et fluorescerende sekundært antistoff genererer en lineær deteksjon profil 4. Dette er i motsetning til ECL teknikker hvor signallineæriteten vanligvis oppstår med lave protein belastninger under 5 mikrogram og signal metning direkte relatert til protein uttrykk, dvs. med overalt uttrykt husholdningsgener 5,6. Dette misforhold er sannsynligvis forårsaket av et større antall bindingsseter tilgjengelig for en avidin ECL substrat for å binde seg til et biotinylert sekundært, noe som resulterer i en høyere sannsynlighet av potensiell signal metning. Dette er en av de viktigste årsakene til ECL basen immunoblotting blir referert til som only "semi-kvantitativ" 7. Metningspunktet for signalet er av avgjørende betydning når man måler små forskjeller i uttrykk nivåer og kan føre til unøyaktige målinger. I de senere årene framveksten av utbredte proteomikk teknikker detaljering stadig økende følsomhet og identifisering av subtile uttrykk differensialer har resultert i en stadig økende avhengighet av virkelig kvantitativ western blotting for valideringsforsøk 8,9. Anvendelsen av sensitive, robust og virkelig kvantitativ metodikk er derfor avgjørende.
Mange "optimalisert" vestlige blotting metoder har blitt benyttet av uavhengige laboratorier, som ofte viser seg vanskelig å sette opp eller replikere grunnet subtile metodiske justeringer som kanskje ikke er synlig i formelle dokumenterte protokoller. Dette er et etablert og robust protokoll for QFWB og i tillegg gir verdifulle strategier for feilsøking vanlige problemer that kan oppstå under gjennomføringen.
Denne protokollen ble opprinnelig optimalisert for bruk med mus hjerne homogenates, men har siden blitt brukt effektivt på tvers av et bredt spekter av vevsprøver og arter 4,9,10. Potensielle protokoll variasjoner som kreves for bestemte feilsøkingsproblemer er inkludert.
Hensyn og planlegging er viktig før noen forsøk, og kan til slutt avgjøre suksessen av teknikken som brukes. Fremskritt i protein deteksjon ved hjelp av WB kan presentere en mengde potensielle snublesteiner når du prøver å velge de riktige antistoffer, overføring og visualisering metoder å bruke. Heldigvis, med et nøye sjekkliste og hensiktsmessige kontrolltiltak QFWB kan brukes rutinemessig for å bestemme protein tilstedeværelse og stadig mer subtile uttrykk forskjeller mellom prøvene. Denne protokollen gir en omfattende guide til fluorescerende kvantitativ western blotting, samt noen få feilsøkings strategier for å unngå og / eller overvinne noen av de mange vanlige fallgruvene knyttet til den.
De kritiske trinn ansatt for å opprettholde følsomheten og få virkelig målbare og sammenlignbare målinger inkluderer: 1) robust protein utvinning fra vevsprøver; 2) prøveopparbeidelse; 3) nøyaktig protein loading bestemt ved total protein-analyse; 4) optimal overføring av proteiner ved hjelp av I-Blot; 5) Fremstilling av primære og sekundære antistoffer i blokkeringsbuffer inneholdende 0,1% Tween 20, og 6) korrekt visualisering og analyse ved hjelp av en infrarød bildefanger og tilhørende programvare.
Fluorescerende deteksjon er virkelig kvantitativ og gir større følsomhet i forhold til mer tradisjonelle ECL deteksjonsteknikker 3,11. Denne deteksjonssystemet er multi fasettert, og som sådan er ikke begrenset til QFWB. Dette systemet er i stand til avbildning av immunohistological merking på lav effekt slik visualisering og kvantifisering av hele vevssnitt 12. Dette er ett område av potensiell fremtidig utvikling i form av vedtak som kan se langt rødt bildebehandling rivaliserende konvensjonell immunfluorescens fange med konvensjonelle mikroskoper i form av kvantitativ vurdering.
Men med større følsomhet overfor subtile endringer i protein uttrykk det er viktig å sikre variabilitet er holdt til et minimum og kontrolltiltak er strenge med robuste protokoller. Dette begynner med streng protein utvinning fra vevsprøve fulgt av produksjonen av totale protein farget gels for å gi sikkerhet for at prøven lasting er uniform, optimalisering av primære og sekundære antistoffer for å avgjøre om påvisning er reell og teste produsentens retningslinjer med hensyn til å overføre ganger for å oppnå effektiv proteinoverføring.
Likevel, selv når forholdene for WB er optimalisert, kan det fortsatt problemer forbundet med å kjøre westernfilmer som kanskje ikke har vært fullt utforsket her. Disse omfatter, men er ikke begrenset til faktorer, inkludert protein solubilisering og valg av ekstraksjonsbuffer. Noen buffere kan interferere med proteinkonsentrasjons assays, og noen vev er spesielt vanskelige å oppløseliggjøre, som krever mer robust teknikker så som bruk av automatisert MaceraTing lukkede beholdere slik som M-rør sammen med en Mac dissociator. I tillegg kan enkle kontrolltiltak for lagring av ekstrahert og ikke-ekstraherte materialet ved -80 ° C være forskjellen mellom å oppnå en optimal merking umiddelbart etter ekstraksjon og ha dårlige resultater uker senere.
Moderne metoder er QFWB vist seg å være mer følsomme for å fange små forskjeller i proteinekspresjon, og er mer allsidig tillater simultan dobbelt merking 3 når sammenlignet med eldre teknikker som ECL. Det er viktig at vestlige blotting protokoller er robust og lett repeterbare for nøyaktig kvantifisering og statistisk analyse. Denne protokollen er følsom og robust nok til å brukes rutinemessig for deteksjon av proteiner tvers av en rekke ulike vevsprøver og arter tre og tillater kvantifisering av lave og høye overflod proteiner innen samme QFWB derfor redusere forbruks bruk samt tid per forsøk 1. 1. I tillegg gjør økt følsomhet av denne teknikken validering av stadig mer populært – omic studier 9,14 men nøyaktighet er avgjørende og inkludering av hensiktsmessige kontrolltiltak må følges dermed unngå feilaktige datainnsamling.
The authors have nothing to disclose.
Vi vil gjerne takker følgende for økonomisk støtte: BBSRC Institute Strategic Programme Funding – CF & TMW; BBSRC East Bio DTP finansiering – LG; The Darwin Trust of Edinburgh – MLH. Vi ønsker også å takke Dr Barry McColl om tillatelse til å inkludere TREM2 optimalisering i dette manuskriptet.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
RIPA Buffer | Fisher Scientific UK Ltd | 10230544 | |
M Tubes | Miltenyi Biotec Inc. | 130-093-236 | |
iBlot Transfer Stack, PVDF Regular | Life technologies, UK | IB401001 | |
MagicMark XP Western Protein Standard (20-220 kDa) | Life technologies, UK | LC5602 | Use in gel 1 for Western blotting |
SeeBlue Pre-stained protein standard | Life technologies, UK | LC5625 | Use in gel 2 Total protein stained gel |
NuPAge LDS Sample buffer 4X | Life technologies, UK | NP0007 | |
NuPAGE MES SDS Running Buffer (for Bis-Tris Gels only) (20X) | Life technologies, UK | NP0002 | |
NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris Gel 1.0 mm, 12 well | Life technologies, UK | NP0322BOX | |
PHOSPHATE BUFFERED SALINE TABLET,*TRU-ME, PHOSPHATE BUFFERED SALINE TABLET | Sigma-Aldrich, UK | P4417-100TAB | |
Micro BCA, Protein Assay Kit | Fisher Scientific UK Ltd | 10249133 | |
Odyssey blocking buffer | Li-Cor Biosciences | P/N 927-40000 | |
IRDye 680RD Goat anti-Rabbit IgG (H+L), 0.5 mg | Li-Cor Biosciences | 926-68071 | |
IRDye 680RD Donkey anti-Mouse IgG (H+L), 0.5 mg | Li-Cor Biosciences | 926-68072 | |
IRDye 800CW Goat anti-Rabbit IgG (H + L), 0.5mg | Li-Cor Biosciences | 926-32211 | |
IRDye 800CW Donkey anti-Goat IgG (H + L), 0.5mg | Li-Cor Biosciences | 926-32214 | |
ODYSSEY CL Infra-red imager | Li-Cor Biosciences | Call for quotation | |
iBlot 7-Minute Blotting System | Life technologies, UK | This model is no longer in production | |
InstantBlue Protein stain | Expedeon, UK | ISB1L | |
Revitablot western blot stripping buffer | Rockland Immunochemicals Inc. | MB-085-0050 |