The advancement of western blotting using fluorescence has allowed detection of subtle changes in protein expression enabling quantitative analyses. Here we describe a robust methodology for detection of a range of proteins across a variety of species and tissue types. A strategy to overcome common technical problems is also provided.
Slutningen af 1970'erne oplevede den første offentligt rapporterede brug af western blot, en teknik til at vurdere tilstedeværelsen og den relative rigelighed af specifikke proteiner i komplekse biologiske prøver. Siden da har western blotting metode bliver en fælles bestanddel af molekylærbiologer eksperimentelle repertoire. En overfladisk søgning af PubMed bruge udtrykket "western blot" antyder, at over 220.000 offentliggjorte manuskripter har gjort brug af denne teknik inden år 2014. Det er vigtigt, har de seneste ti år oplevet tekniske billeddiagnostiske fremskridt kombineret med udviklingen af følsomme fluorescensmærker som har forbedret følsomhed og gav endnu større serier af lineær detektion. Resultatet er en nu virkelig kvantificerbare Fluorescens baserede Western Blot (QFWB), der tillader biologer til at foretage sammenlignende udtryk analyse med større følsomhed og præcision end nogensinde før. Mange "optimeret" western blottingDer findes metoder og anvendes i forskellige laboratorier. Disse bevise ofte vanskelige at gennemføre på grund af kravet om subtile men udokumenterede proceduremæssige ændringer. Denne protokol giver en samlet beskrivelse af en etableret og robust QFWB metode, komplet med strategier fejlfinding.
Western blotting (WB) er en analytisk teknik, der oprindeligt blev udviklet i slutningen af 1970'erne for at bestemme tilstedeværelsen eller fraværet af et protein af interesse i en kompleks biologisk prøve, såsom en vævshomogenat 1. Almindeligvis benævnt proteinet immunoblot, på grund af den centrale antistof-antigen-interaktion, metoden består af 5 forskellige trin: 1) elektroforetisk separation af proteiner ved deres isoelektriske punkt; 2) overførsel til en nitrocellulose eller polyvinylidendifluorid (PVDF) membran; 3) mærkning ved hjælp af et primært antistof specifikt for proteinet af interesse; 4) inkubation med et sekundært antistof rettet mod det primære antistof; og 5) visualisering.
Visualisering metode har udviklet sig med tiden for at forbedre sikkerheden og følsomhed. Nogle af de første WBS blev udført under anvendelse af radio- mærkede tags som derefter progredierede til kolorimetrisk og derefter mere udbredt chemilluminescent (ECL) metoder. Radioactivity blev direkte mærket på prober for specifikke antigener henviser kolorimetriske og ECL metoder bruger en indirekte mærkning teknik med et enzym reporter såsom alkalisk phosphatase eller streptavidin peberrods-peroxidase (HRP) 2. Intensiteten af mærkningen af chromagen eller luminescerende produkt måles ved hjælp af densitometri, hvorved signalstyrke, stærk eller svag, angiver mere eller mindre tilstedeværelse af proteinet af interesse i prøven. ECL er mere følsomme og derfor begunstiget metode 2, men alle 3 metoder blev oprindeligt udviklet på røntgenfilm med mere sofistikerede digital billedbehandling teknikker efterfølgende etableret 3. Fremme af digital billeddannelse af WB ikke kun tilladt en forsker til at bestemme tilstedeværelsen eller fraværet af deres protein af interesse, men gav også en slutning til niveauet af ekspression af et udvalgt protein, når sammenlignet med andre prøver og kan derfor omtales som "semi-kvantitativ & #8221 ;. For nylig er en virkelig kvantitativ og mere følsomme Western-blotting-teknologi er udviklet, hvorved niveauet af fluorescens måles er direkte relateret til mængden og ekspression af et enkelt protein i en prøve: kvantitativt fluorescerende western blotting (QFWB).
Når man sammenligner QFWB med ECL mærkning, anvendelse af et fluorescerende sekundært antistof genererer en lineær detektering profil 4. Dette er i modsætning til ECL-teknikker hvor signallinearitet generelt sker med lave protein belastninger under 5 ug og signal mætning direkte relateret til protein-ekspression, dvs. med allestedsnærværende udtrykte husholdning gener 5,6. Denne forskel er mest sandsynligt forårsaget af et større antal bindingssteder til rådighed for en avidin ECL-substrat at binde til et biotinyleret sekundært, hvilket resulterer i en højere sandsynlighed for potentielle signal mætning. Dette er en af de vigtigste årsager til ECL basen immunoblotting benævnes only "semi-kvantitativ" 7. Mætningspunkt signal er af afgørende betydning ved måling subtile forskelle i ekspressionsniveauer og kan føre til unøjagtige målinger. I de senere år fremkomsten af udbredte proteomiske teknikker beskriver stadigt stigende følsomhed og identifikation af subtile udtryk forskelle har resulteret i et stadigt stigende afhængighed af virkelig kvantitativ western blotting til validering eksperimenter 8,9. Anvendelsen af følsomme, robuste og virkelig kvantitativ metode er derfor afgørende.
Mange "optimeret" vestlige blotting metoder er blevet anvendt af uafhængige laboratorier, som ofte være vanskeligt at oprette eller kopiere grundet subtile metodiske justeringer, der måske ikke er synlige i formelle dokumenterede protokoller. Dette er en veletableret og robust protokol for QFWB og derudover giver værdifulde strategier til fejlfinding af almindelige problemer that kan opstå under gennemførelsen.
Denne protokol blev oprindelig optimeret til brug med murine hjernehomogenater, men er siden blevet brugt effektivt på tværs af en bred vifte af vævsprøver og arter 4,9,10. Potentielle protokol variationer kræves for fejlfinding specifikke spørgsmål er inkluderet.
Due consideration and planning is essential prior to any experiment and can ultimately determine the success of the technique used. The advancements in protein detection using WB can present a plethora of potential stumbling blocks when trying to choose the appropriate antibodies, transfer and visualization methods to use. Fortunately, using a careful checklist and appropriate control measures QFWB can be used routinely to determine protein presence and increasingly subtle expression differences between samples. This protocol provides a comprehensive guide to fluorescent quantitative western blotting as well as a few troubleshooting strategies to avoid and/or overcome some of the many common pitfalls associated with it.
The critical steps employed to maintain sensitivity and obtain truly quantifiable and comparable measurements include: 1) robust protein extraction from tissue samples; 2) sample preparation; 3) accurate protein loading determined by total protein analysis; 4) optimal transfer of proteins using I-Blot; 5) preparation of primary and secondary antibodies in blocking buffer containing 0.1% Tween20, and 6) correct visualization and analysis using an infrared imager and associated software.
Infrared fluorescent detection is truly quantitative and provides greater sensitivity compared with more traditional ECL detection techniques3,11. This detection system is multi faceted, and as such is not limited to QFWB. This system is capable of imaging of immunohistological labeling at low power allowing visualization and quantification of whole tissue sections12. This is one area of potential future development in terms of resolution which could see far red imaging rivaling conventional immunofluorescence capturing with conventional microscopes in terms of quantitative assessment.
However, with greater sensitivity to subtle changes in protein expression it is crucial to ensure variability is kept to a minimum and control measures are stringent with robust protocols. This begins with rigorous protein extraction from the tissue sample followed by production of total protein stained gels to provide assurance that sample loading is uniform, optimization of primary and secondary antibodies in order to determine if detection is real and testing the manufacturer's guidelines with regard to transfer times to obtain efficient protein transfer.
Nevertheless, even when conditions for WB are optimized, there may still problems associated with running westerns that may not have been fully explored here. These include but are not limited to factors including protein solubilization and choice of extraction buffer. Some buffers can interfere with protein concentration assays, and some tissues are particularly difficult to solubilize, requiring more robust techniques such as the use of automated macerating sealed containers such as M tubes together with a Macs dissociator. In addition, simple control measures for storage of extracted and non-extracted material at -80 °C can be the difference between obtaining optimal labeling immediately after extraction and having poor results weeks later.
Modern QFWB methods are proven to be more sensitive for capturing subtle differences in protein expression and are more versatile allowing simultaneous dual labeling3 when compared to older techniques such as ECL. It is vital that western blotting protocols are robust and readily repeatable for accurate quantification and statistical analysis. This protocol is sensitive and robust enough to be used routinely for detection of proteins across a variety of different tissue samples and species3 and allows quantification of low and high abundance proteins within the same QFWB therefore reducing consumable usage as well as time per experiment11. In addition, the increased sensitivity of this technique allows validation of increasingly popular –omic studies9,14 however accuracy is crucial and inclusion of appropriate control measures must be adhered to thereby avoiding erroneous data acquisition.
The authors have nothing to disclose.
We would like to thanks the following for financial support: BBSRC Institute Strategic Programme Funding – CF & TMW; BBSRC East Bio DTP funding – LG; The Darwin Trust of Edinburgh – MLH. We would also like to thank Dr Barry McColl for permission to include the TREM2 optimization in this manuscript.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
RIPA Buffer | Fisher Scientific UK Ltd | 10230544 | |
M Tubes | Miltenyi Biotec Inc. | 130-093-236 | |
iBlot Transfer Stack, PVDF Regular | Life technologies, UK | IB401001 | |
MagicMark XP Western Protein Standard (20-220 kDa) | Life technologies, UK | LC5602 | Use in gel 1 for Western blotting |
SeeBlue Pre-stained protein standard | Life technologies, UK | LC5625 | Use in gel 2 Total protein stained gel |
NuPAge LDS Sample buffer 4X | Life technologies, UK | NP0007 | |
NuPAGE MES SDS Running Buffer (for Bis-Tris Gels only) (20X) | Life technologies, UK | NP0002 | |
NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris Gel 1.0 mm, 12 well | Life technologies, UK | NP0322BOX | |
PHOSPHATE BUFFERED SALINE TABLET,*TRU-ME, PHOSPHATE BUFFERED SALINE TABLET | Sigma-Aldrich, UK | P4417-100TAB | |
Micro BCA, Protein Assay Kit | Fisher Scientific UK Ltd | 10249133 | |
Odyssey blocking buffer | Li-Cor Biosciences | P/N 927-40000 | |
IRDye 680RD Goat anti-Rabbit IgG (H+L), 0.5 mg | Li-Cor Biosciences | 926-68071 | |
IRDye 680RD Donkey anti-Mouse IgG (H+L), 0.5 mg | Li-Cor Biosciences | 926-68072 | |
IRDye 800CW Goat anti-Rabbit IgG (H + L), 0.5mg | Li-Cor Biosciences | 926-32211 | |
IRDye 800CW Donkey anti-Goat IgG (H + L), 0.5mg | Li-Cor Biosciences | 926-32214 | |
ODYSSEY CL Infra-red imager | Li-Cor Biosciences | Call for quotation | |
iBlot 7-Minute Blotting System | Life technologies, UK | This model is no longer in production | |
InstantBlue Protein stain | Expedeon, UK | ISB1L | |
Revitablot western blot stripping buffer | Rockland Immunochemicals Inc. | MB-085-0050 |