JoVE Journal > Chemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
자동 번역
화학

Fluorescens-baserede Overvågning af PAD4 aktivitet via en Pro-fluorescens substratanalog

Published: November 05, 2014
doi:
10.3791/52114
, ,
1Department of Chemistry,Lehigh University

Summary

PAD4 is an enzyme responsible for the conversion of peptidyl-arginine to peptidyl-citrulline. Dysregulation of PAD4 has been implicated in a number of human diseases. A facile and high-throughput compatible fluorescence based PAD4 assay is described.

Abstract

Post-translational modifications may lead to altered protein functional states by increasing the covalent variations on the side chains of many protein substrates. The histone tails represent one of the most heavily modified stretches within all human proteins. Peptidyl-arginine deiminase 4 (PAD4) has been shown to convert arginine residues into the non-genetically encoded citrulline residue. Few assays described to date have been operationally facile with satisfactory sensitivity. Thus, the lack of adequate assays has likely contributed to the absence of potent non-covalent PAD4 inhibitors. Herein a novel fluorescence-based assay that allows for the monitoring of PAD4 activity is described. A pro-fluorescent substrate analog was designed to link PAD4 enzymatic activity to fluorescence liberation upon the addition of the protease trypsin. It was shown that the assay is compatible with high-throughput screening conditions and has a strong signal-to-noise ratio. Furthermore, the assay can also be performed with crude cell lysates containing over-expressed PAD4.

Introduction

Et stort antal af mammale proteiner er stærkt modificeret af virkningen af ​​enzymer efter biosyntesen af ​​proteiner ved ribosomet. Disse post-translationelle modifikationer (PTMS) vil forøge funktionel diversitet af proteom ved at ændre størrelse, ladning, struktur og oligomerisering tilstand (blandt andre funktioner) af proteiner 1-3. Som et resultat, kan ændringen i proteinstruktur føre til fysiologiske konsekvenser, såsom proteinnedbrydning, cellulær differentiering, signalering, modulation i genekspression og protein-protein interaktioner. Mens disse ændringer er udbredt i en stor procentdel af alle menneskelige proteiner, terminalen slutter den histonproteiner gennemgå et usædvanligt højt antal af kovalente 4 modifikationer. Histonproteiner er en familie af strukturelle proteiner, der letter kondenseringen af ​​genomisk DNA. Kovalente modifikationer af de ustrukturerede histon haler udføres og reguleres af en series af enzymer, der kan katalysere den kovalente modifikation af rester (forfattere), vende den samme modifikationer (viskelædere), og skelne mellem de ændringer, der prentet onto histon haler (læserne), 5-7. Faktisk kan de fleste af de kendte PTMS observeres inden for dette korte segment af histon herunder methylering, phosphorylering, acetylering, sumoylation, ubiquitinering og citrullination 8.

Citrullination involverer omdannelse af peptidyl-arginin til ikke- t RNA kodet peptidyl-citrullin (figur 1A). De proteiner, der er ansvarlige for denne sidekæde neutralisering, er medlemmer af PAD (p eptide en rginine d eiminase) protein familie, som alle er calcium-afhængige enzymer. 9,10. Til dato har fem medlemmer af PAD familien blevet beskrevet (PAD1, PAD2, PAD3, PAD4 og PAD6). Hvert medlem af denne familie synes at målrette forskellige cellulære proteiner og viser også unique vævsdistribution profiler. PAD4 er det eneste medlem af denne familie protein kendt for at være lokaliseret i kernen via en kernelokaliseringssekvens 11. Følgelig er det blevet vist at deiminate en række nukleare mål, herunder arginin sidekæder på de N-terminale haler af histoner H2A argininrest 3 (H2R3), H3 (H3R2, H3R17 og H3R26) og H4 (H4R3) 12, 13. Mens hver af PAD isozymer har specifikke og kritiske fysiologiske funktioner, har PAD4 fået betydelig mere opmærksomhed på grund af sin rolle i en række humane processer i både syge og raske celler. For nylig blev PAD4 vist sig at være et medlem af pluripotens transkriptionelle netværk 14. Begge PAD4 ekspressionsniveauer og aktivitet viste sig at være forhøjet i løbet af omprogrammering og jord-statslige pluripotente stater i mus. Ved at styre reguleringen af ​​stamcelle-gener, kan PAD4 bevare en central rolle i cellulær omprogrammering effektivitet. PAD4 har også været impliceret idannelse af neutrofile ekstracellulære fælder, som ved binding af patogener sætte deres system clearance. Den hypercitrullination af histonproteinerne af PAD4 inducerer dekondensering af chromatin, der tjener som basismateriale til indkapsling af patogene bakterier fra det ekstracellulære fælde, således afværge bakterielle infektioner 15,16.

Derudover har PAD4 vist sig at spille en aktiv rolle i en række humane sygdomme. Det er tidligere blevet vist, at afvigende ekspression af PAD4 er forbundet med indtræden og sværhedsgraden af rheumatoid arthritis, Alzheimers sygdom, Parkinsons sygdom og dissemineret sklerose 17. I virkeligheden tilstedeværelsen af anti-citrullinerede proteinantistoffer er en af de mest pålidelige og endelige diagnostiske og prognostiske biomarkører for rheumatoid arthritis 18. Ligeledes har dysreguleret PAD4 aktivitet for nylig blevet observeret i en række humane cancere, herunder ovarie-, bryst-, lunge-, end esophageal kræftformer 19-22. Har vist sammenhængen mellem PAD4 og cancer at være medieret gennem Elk1 onkogen eller via p53 tumor suppressor protein 22,23 og tidligere arbejde har antydet, at PAD4 kunne være et hidtil ukendt anti-cancer terapeutisk mål 17,24,25. Som et proof of principle studie blev udtømningen af PAD4 via shRNA i kolorektal cancer cellelinie HCT116 afsløret at være tilstrækkelig til at inducere apoptose og cellecyklusstandsning 26. En nyligt udviklet irreversibel PAD4 inhibitor førte til en halvfjerds procent reduktion i tumormasse i mus 27. Ganske bemærkelsesværdigt, PAD4 hæmning viste sig at fungere som en målrettet terapi, der resulterede i selektivt drab af kræftceller samtidig skåne transformerede celler.

Brugen af små molekyler for at slukke funktionen af PAD4 kan vise sig at være en kraftfuld ny strategi til at målrette kræftceller eller at forøge eksisterende cancer kemoterapeutika 28. Desværre, en potelt reversible PAD4 inhibitor er endnu at blive opdaget. En række af kovalente hæmmere er blevet udviklet ved hjælp af chlor / fluor imidine håndtag, der efterligner arginin underlaget 27,29,30 og har vist sig at være praktiske værktøjer til at forstå den rolle, PAD4 hos både raske og syge statslige celler. Men disse molekyler inhibere alle de aktive puder med lignende styrke. Derfor behovet for en let assay, der rapporterer om aktiviteten af ​​PAD4 er afgørende. Til dato har PAD4 assays blevet beskrevet at forbinde frigivelsen af ammoniak fra reaktionen til et kolorimetrisk udlæsning 31, anvende en fluorescensmærket chloroamidine substratanalog for fluorescenspolarisering assay 32, stole på syre-assisteret reaktion mellem glyoxal og citrullin 33, og koble PAD4 aktivitet til et fluorescens-dequenching trin 34. Af disse er kun den kovalente modifier haloacetamidine strategi har vist sig at være forenelige med high-throughput screening platforme 32,35,36. Vi beskriver en letkøbt fluorescens assay, som pålideligt måler aktiviteten af ​​PAD4. Assayet, som viser et stærkt signal-til-støjforhold, hastighed af analyse og robusthed måling, har potentialet til at opdage en virkelig potent og selektiv PAD4 inhibitor.

Protocol

1. PAD4 Transformation, udtryk og oprensning For PAD4 Transformation, omdanne pGEX plasmidet indeholdende PAD4 GST fusion i kemisk kompetente E. Coli (BL21 (DE3)) celler til proteinekspression ved hjælp af følgende procedure. Forbered kemisk kompetent (calciumchlorid) E. Coli (BL21 (DE3)) celler ifølge standardprotokoller. Thaw 50 pi af tidligere fremstillet kemisk kompetente BL21 (DE3) celler på is og blandes med 1 ml af pGEX plasmid indeholdende PAD4 gen i en 5 ml kultur rør….

Representative Results

I første omgang blev det påvist, at ZRcoum kan rapportere om aktiviteten af PAD4 i en 96-brønds plade-format. Brønde blev inkuberet med substratet ZRcoum og i nærvær / fravær af PAD4. Efter en inkubationsperiode på 45 minutter ved 37 ° C blev fluorescensen målt med et 340/40 – 475/15 nm filter (figur 2A). Som forventet niveauer af fluorescens forblev lav som fluoroforen inden ZRcoum (eller citrullinerede ZRcoum) forblev i lås…

Discussion

Herein, a fluorescence based assay was successfully developed that monitors the activity of PAD4. The assay has proven to be incredibly robust in a number of high-throughput conditions and is also compatible with whole cell lysates37.

The affinity between the histone proteins and the DNA strands surrounding it loosens due the neutralization of the positive charge on the arginine side chain upon citrullination. It was envisioned that the neutralization of the arginine side-chain coul…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by the Lehigh University Start-up Package. We thank Dr. Walter Fast for providing the GST-PAD4 plasmid for protein expression.

Materials

Name of the Material/Equipment Company Catalog Number Comments/ Description
LB Broth, Miller (LURIA-BERTANI) Amresco J106-2KG http://www.amresco-inc.com
Ampicillin Trihydrate (Off-white Powder), Fisher BioReagents Fisher Scientific BP902-25  http://www.fishersci.com
Isopropylthiagalactonse (IPTG) Life Technogolies 15529-019 http://www.lifetechnologies.com
All Buffer Salts  Fisher Scientific N/A Can purchase from Fisher Scieintifc; VWR; Acros; Sigma-Aldrich; etc.
Protino Glutathione (GSH) agarose  Machery-Nagel 745500.10 Store at 4 °C; http://www.mn-net.com/
Z-​Arg-​Arg-​7-​amido-​4-​methylcoumarin hydrochloride (Zcoum) Sigma Aldrich C5429 www.sigmaaldrich.com
Chloroamidine  Cayman Chemical  10599 Store at -20 °C; https://www.caymanchem.com/app/template/Home.vm
Tris(2-​carboxyethyl)​phosphine hydrochloride (TCEP HCl) Thermo Scientifc 20490 http://www.piercenet.com
Triton X-100 Sigma Aldrich X100-100ML www.sigmaaldrich.com
Corning/Nunclon MicroWell plates (96 and 384) N/A N/A Purchase from Corning; Sigma-Aldrich
Tecan Infinite 200 / Tecan i-control microplate reader software N/A N/A www.tecan.com
Europium Ex. 340/40 Em. 475/15 filter N/A N/A http://www.perkinelmer.com
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jensen, O. N. Interpreting the protein language using proteomics. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7, 391-403 (2006).
  2. Sims, R. J., Reinberg, D. Is there a code embedded in proteins that is based on post-translational modifications. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9, 815-820 (2008).
  3. Pandey, A., Mann, M. Proteomics to study genes and genomes. Nature. 405, 837-846 (2000).
  4. Berger, S. L. The complex language of chromatin regulation during transcription. Nature. 447, 407-412 (2007).
  5. Fischle, W., Wang, Y., Allis, C. D. Binary switches and modification cassettes in histone biology and beyond. Nature. 425, 475-479 (2003).
  6. Taverna, S. D., Li, H., Ruthenburg, A. J., Allis, C. D., Patel, D. J. How chromatin-binding modules interpret histone modifications: lessons from professional pocket pickers. Nat. Struct. Mol. Biol. 14, 1025-1040 (2007).
  7. Seet, B. T., Dikic, I., Zhou, M. M., Pawson, T. Reading protein modifications with interaction domains. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7, 473-483 (2006).
  8. Strahl, B. D., Allis, C. D. The language of covalent histone modifications. Nature. 403, 41-45 (2000).
  9. Vossenaar, E. R., Zendman, A. J., van Venrooij, W. J., Pruijn, G. J. PAD, a growing family of citrullinating enzymes: genes, features and involvement in disease. Bioessays. 25, 1106-1118 (2003).
  10. Gyorgy, B., Toth, E., Tarcsa, E., Falus, A., Buzas, E. I. Citrullination: a posttranslational modification in health and disease. Int. J. Biochem. Cell Biol. 38, 1662-1677 (2006).
  11. Nakashima, K., Hagiwara, T., Yamada, M. Nuclear localization of peptidylarginine deiminase V and histone deimination in granulocytes. J. Biol. Chem. 277, 49562-49568 (2002).
  12. Hagiwara, T., Hidaka, Y., Yamada, M. Deimination of histone H2A and H4 at arginine 3 in HL-60 granulocytes. 생화학. 44, 5827-5834 (2005).
  13. Kearney, P. L., et al. Kinetic characterization of protein arginine deiminase 4: a transcriptional corepressor implicated in the onset and progression of rheumatoid arthritis. 생화학. 44, 10570-10582 (2005).
  14. Christophorou, M. A., et al. Citrullination regulates pluripotency and histone H1 binding to chromatin. Nature. 507 (7490), 104-108 (2014).
  15. Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303, 1532-1535 (2004).
  16. Li, P., et al. PAD4 is essential for antibacterial innate immunity mediated by neutrophil extracellular traps. J. Exp. Med. 207, 1853-1862 (2010).
  17. Wang, Y., et al. Histone hypercitrullination mediates chromatin decondensation and neutrophil extracellular trap formation. J. Cell. Biol. 184, 205-213 (2009).
  18. Wang, S., Wang, Y. Peptidylarginine deiminases in citrullination, gene regulation, health and pathogenesis. Biochim. Biophys. Acta. 1829, 1126-1135 (2013).
  19. Trouw, L. A., Mahler, M. Closing the serological gap: promising novel biomarkers for the early diagnosis of rheumatoid arthritis. Autoimmun. Rev. 12, 318-322 (2012).
  20. Chang, X., Fang, K. PADI4 and tumourigenesis. Cancer Cell Int. 10, 7 (2010).
  21. Wang, L., Chang, X., Yuan, G., Zhao, Y., Wang, P. Expression of peptidylarginine deiminase type 4 in ovarian tumors. Int. J. Biol. Sci. 6, 454-464 (2010).
  22. Chang, X., et al. Investigating the pathogenic role of PADI4 in oesophageal cancer. Int. J. Biol. Sci. 7, 769-781 (2011).
  23. Zhang, X., et al. Genome-wide analysis reveals PADI4 cooperates with Elk-1 to activate c-Fos expression in breast cancer cells. PLoS Genet. 7, (2011).
  24. Tanikawa, C., et al. Regulation of histone modification and chromatin structure by the p53-PADI4 pathway. Nat. Commun. 3, 676 (2012).
  25. Cui, X., et al. The induction of microRNA-16 in colon cancer cells by protein arginine deiminase inhibition causes a p53-dependent cell cycle arrest. PLos One. 8, (2013).
  26. Jones, J. E., Causey, C. P., Knuckley, B., Slack-Noyes, J. L., Thompson, P. R. Protein arginine deiminase 4 (PAD4): Current understanding and future therapeutic potential. Curr. Opin. Drug Discov. Devel. 12, 616-627 (2009).
  27. Li, P., et al. Regulation of p53 target gene expression by peptidylarginine deiminase 4. Mol. Cell Biol. 28, 4745-4758 (2008).
  28. Wang, Y., et al. Anticancer peptidylarginine deiminase (PAD) inhibitors regulate the autophagy flux and the mammalian target of rapamycin complex 1 activity. J. Biol. Chem. 287, 25941-25953 (2012).
  29. Slack, J. L., Causey, C. P., Thompson, P. R. Protein arginine deiminase 4: a target for an epigenetic cancer therapy. Cell. Mol. Life Sci. 68, 709-720 (2011).
  30. Luo, Y., Knuckley, B., Lee, Y. H., Stallcup, M. R., Thompson, P. R. A fluoroacetamidine-based inactivator of protein arginine deiminase 4: design, synthesis, and in vitro and in vivo evaluation. J. Am. Chem. Soc. 128, 1092-1093 (2006).
  31. Knuckley, B., et al. Substrate specificity and kinetic studies of PADs. 생화학. 1, 4852-4863 (2010).
  32. Knipp, M., Vasak, M. A colorimetric 96-well microtiter plate assay for the determination of enzymatically formed citrulline. Anal. Biochem. 286, 257-264 (2000).
  33. Knuckley, B., et al. A fluopol-ABPP HTS assay to identify PAD inhibitors. Chem. Commun. 46, 7175-7177 (2010).
  34. Bicker, K. L., Subramanian, V., Chumanevich, A. A., Hofseth, L. J., Thompson, P. R. Seeing citrulline: development of a phenylglyoxal-based probe to visualize protein citrullination. J. Am. Chem. Soc. 134, 17015-17018 (2012).
  35. Wang, Q., Priestman, M. A., Lawrence, D. S. Monitoring of protein arginine deiminase activity by using fluorescence quenching: multicolor visualization of citrullination. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 52, 2323-2325 (2013).
  36. Jones, J. E., et al. Synthesis and screening of a haloacetamidine containing library to identify PAD4 selective inhibitors. ACS Chem. Biol. 7, 160-165 (2012).
  37. Dreyton, C. J., et al. . Optimization and characterization of a pan protein arginine deiminase (PAD) inhibitor. , (2010).
  38. Shimoyama, S., et al. Deimination stabilizes histone H2A/H2B dimers as revealed by electrospray ionization mass spectrometry. J. Mass Spectrom. 45, 900-908 (2010).
  39. Luo, Y., et al. Inhibitors and inactivators of protein arginine deiminase 4: functional and structural characterization. 생화학. 45, 11727-11736 (2006).

Tags

Fluorescence-based AssayPAD4 ActivityPro-fluorescence Substrate AnalogPost-translational ModificationsHistone TailsArginine To Citrulline ConversionHigh-throughput ScreeningCell LysatesPAD4 Over-expression
check_url/kr/52114?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Sabulski, M. J., Fura, J. M., Pires, M. M. Fluorescence-based Monitoring of PAD4 Activity via a Pro-fluorescence Substrate Analog. J. Vis. Exp. (93), e52114, doi:10.3791/52114 (2014).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image