Флуоресценции основе Контроль PAD4 деятельности через Pro-флуоресцентной субстрата Analog
Summary
PAD4 is an enzyme responsible for the conversion of peptidyl-arginine to peptidyl-citrulline. Dysregulation of PAD4 has been implicated in a number of human diseases. A facile and high-throughput compatible fluorescence based PAD4 assay is described.
Abstract
Post-translational modifications may lead to altered protein functional states by increasing the covalent variations on the side chains of many protein substrates. The histone tails represent one of the most heavily modified stretches within all human proteins. Peptidyl-arginine deiminase 4 (PAD4) has been shown to convert arginine residues into the non-genetically encoded citrulline residue. Few assays described to date have been operationally facile with satisfactory sensitivity. Thus, the lack of adequate assays has likely contributed to the absence of potent non-covalent PAD4 inhibitors. Herein a novel fluorescence-based assay that allows for the monitoring of PAD4 activity is described. A pro-fluorescent substrate analog was designed to link PAD4 enzymatic activity to fluorescence liberation upon the addition of the protease trypsin. It was shown that the assay is compatible with high-throughput screening conditions and has a strong signal-to-noise ratio. Furthermore, the assay can also be performed with crude cell lysates containing over-expressed PAD4.
Introduction
Большое количество белков млекопитающих в значительной степени изменены под действием ферментов следующей биосинтеза белков рибосомой. Эти пост-трансляционные модификации (PTMs) может значительно увеличить функциональное разнообразие протеоме, изменяя размер, заряд, структуру и состояние олигомеризации (среди других особенностей) белков 1-3. В результате, изменение в структуре белка может привести к физиологических последствий, таких как деградации белка, клеточной дифференцировки, сигнализации, в модуляции экспрессии гена, и белок-белковых взаимодействий. В то время как эти модификации распространены в большом проценте всех белков человека, терминал заканчивается на гистоновых белков пройти необычно высокое число ковалентных модификаций 4. Гистоновых белков представляют собой семейство структурных белков, которые способствуют конденсации геномной ДНК. Ковалентные модификации неструктурированных гистонов осуществляется и регулируется серииы ферментов, которые могут катализировать ковалентной модификации остатков (писатели), обратного те же изменения (ластики), и различие между изменениями импринтируемые на гистонов (читателей) 5-7. В самом деле, большинство известных PTMs можно наблюдать в течение этого короткого отрезка гистона включая метилирование, фосфорилирование, ацетилирование, SUMOylation, убиквитинирования, и citrullination 8.
Citrullination включает конверсию пептидил-аргинина к не-т РНК кодируется пептидил-цитруллин (Фигура 1А). Белки, отвечающие за этот боковой цепи нейтрализации, являются членами ОП (р eptide в rginine D eiminase) семейства белков, все из которых являются кальций-зависимых ферментов. 9,10. На сегодняшний день, пять членов семьи PAD были описаны (PAD1, pad2, PAD3, PAD4 и PAD6). Каждый член этого семейства появляется целевой различных клеточных белков, а также отображает UNIQue распределительные ткани профили. PAD4 является единственным членом этого семейства белков как известно, локализованный в ядре с помощью последовательности ядерной локализации 11. Соответственно, было показано, что deiminate ряд ядерных мишеней, в том числе аргинина боковых цепей на N-концевых хвостов гистонов H2A остатка аргинина 3 (H2R3), Н3 (H3R2, H3R17, и H3R26) и H4 (H4R3) 12, 13. В то время как каждый из PAD изоферментов есть конкретные и важные физиологические функции, PAD4 получил значительно больше внимания из-за его роли в ряде населенных процессов в обоих больных и здоровых клеток. В последнее время, PAD4 было показано, что член плюрипотентность транскрипционной сети 14. Оба уровни экспрессии PAD4 и деятельность были показаны, что повышается во время перепрограммирования и основного состояния плюрипотентных государств на мышах. Управляя регуляции генов стволовых клеток, PAD4 может сохранить ключевую роль в эффективности клеточного перепрограммирования. PAD4 также участвует вформирование нейтрофилов внеклеточных ловушек, которые при связывании патогенов включить их системы очистки. Hypercitrullination из гистоновых белков путем PAD4 индуцирует деконденсацию хроматина, который служит в качестве базового материала для инкапсуляции патогенных бактерий путем внеклеточного ловушку, тем самым отвести бактериальных инфекций 15,16.
Кроме того, PAD4 было установлено, играть активную роль в ряде заболеваний человека. Ранее было показано, что аберрантная экспрессия PAD4 связан с началом и тяжести ревматоидного артрита, болезни Альцгеймера, болезни Паркинсона, рассеянный склероз и 17. В самом деле, присутствие анти-цитруллинированных белковых антител является одним из наиболее надежных и окончательных диагностических и прогностических биомаркеров ревматоидного артрита 18. Аналогичным образом, нарушением регуляции активности PAD4 недавно было отмечено в ряде злокачественных опухолей человека, включая рак яичников, молочной железы, легкого, сг рака пищевода 19-22. Связь между PAD4 и рака было показано, чтобы быть опосредованы через онкогена ELK1 или через супрессора опухолевого белка р53 22,23 и предыдущая работа предположил, что PAD4 может быть новым противораковым терапевтической мишенью 17,24,25. В качестве доказательства принцип исследования, истощение PAD4 через shRNA в колоректального клеточной линии рака НСТ116 Было показано, что достаточно для индукции апоптоза и клеточного цикла 26. Недавно был разработан необратимый ингибитор PAD4 привело к снижению массы опухоли у мышей 27 в семьдесят процентов. Довольно удивительно, PAD4 торможение, казалось, выступать в качестве целевой терапии, в результате селективного убийства раковых клеток, щадя непреобразованной клетки.
Использование малых молекул, чтобы выключить функцию PAD4 может оказаться мощным новая стратегия, чтобы раковые клетки или дополнить существующие химиотерапевтические рака 28. К сожалению, POПалатка обратимым PAD4 ингибитор еще предстоит открыть. Ряд ингибиторов ковалентных были разработаны с использованием хлора / фтора imidine ручку, который имитирует аргинин субстрат 27,29,30 и зарекомендовали себя как практические инструменты для понимания роли PAD4 в обоих здоровых и больных государственных клеток. Тем не менее, эти молекулы ингибируют все активные колодки с аналогичной активностью. Таким образом, потребность в поспешном анализа, который сообщает о деятельности PAD4 имеет решающее значение. На сегодняшний день PAD4 анализы были описаны, что связать высвобождение аммиака в результате реакции на колориметрический считывания 31, используют флуоресцентно меченого субстрата chloroamidine аналог для поляризации флуоресценции анализа 32, опираются на реакции кислоты при содействии между глиоксаля и цитруллина 33, и пара деятельность PAD4 к флуоресценции шаг 34 dequenching. Из них только ковалентная модификатор стратегия haloacetamidine доказал, чтобы быть совместимым с высокой пропускной Screрение платформы 32,35,36. Мы описываем легкое флуоресценции, основанный анализ, который надежно измеряет активность PAD4. Анализ, который отображает сильный сигнал-шум, скорость анализа и надежности измерений, имеет потенциал, чтобы открыть для себя по-настоящему мощным и селективным ингибитором PAD4.
Protocol
Representative Results
Discussion
Herein, a fluorescence based assay was successfully developed that monitors the activity of PAD4. The assay has proven to be incredibly robust in a number of high-throughput conditions and is also compatible with whole cell lysates37.
The affinity between the histone proteins and the DNA strands surrounding it loosens due the neutralization of the positive charge on the arginine side chain upon citrullination. It was envisioned that the neutralization of the arginine side-chain coul…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Lehigh University Start-up Package. We thank Dr. Walter Fast for providing the GST-PAD4 plasmid for protein expression.
Materials
| Name of the Material/Equipment | Company | Catalog Number | Comments/ Description |
| LB Broth, Miller (LURIA-BERTANI) | Amresco | J106-2KG | http://www.amresco-inc.com |
| Ampicillin Trihydrate (Off-white Powder), Fisher BioReagents | Fisher Scientific | BP902-25 | http://www.fishersci.com |
| Isopropylthiagalactonse (IPTG) | Life Technogolies | 15529-019 | http://www.lifetechnologies.com |
| All Buffer Salts | Fisher Scientific | N/A | Can purchase from Fisher Scieintifc; VWR; Acros; Sigma-Aldrich; etc. |
| Protino Glutathione (GSH) agarose | Machery-Nagel | 745500.10 | Store at 4 °C; http://www.mn-net.com/ |
| Z-Arg-Arg-7-amido-4-methylcoumarin hydrochloride (Zcoum) | Sigma Aldrich | C5429 | www.sigmaaldrich.com |
| Chloroamidine | Cayman Chemical | 10599 | Store at -20 °C; https://www.caymanchem.com/app/template/Home.vm |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP HCl) | Thermo Scientifc | 20490 | http://www.piercenet.com |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100-100ML | www.sigmaaldrich.com |
| Corning/Nunclon MicroWell plates (96 and 384) | N/A | N/A | Purchase from Corning; Sigma-Aldrich |
| Tecan Infinite 200 / Tecan i-control microplate reader software | N/A | N/A | www.tecan.com |
| Europium Ex. 340/40 Em. 475/15 filter | N/A | N/A | http://www.perkinelmer.com |
References
- Jensen, O. N. Interpreting the protein language using proteomics. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7, 391-403 (2006).
- Sims, R. J., Reinberg, D. Is there a code embedded in proteins that is based on post-translational modifications. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9, 815-820 (2008).
- Pandey, A., Mann, M. Proteomics to study genes and genomes. Nature. 405, 837-846 (2000).
- Berger, S. L. The complex language of chromatin regulation during transcription. Nature. 447, 407-412 (2007).
- Fischle, W., Wang, Y., Allis, C. D. Binary switches and modification cassettes in histone biology and beyond. Nature. 425, 475-479 (2003).
- Taverna, S. D., Li, H., Ruthenburg, A. J., Allis, C. D., Patel, D. J. How chromatin-binding modules interpret histone modifications: lessons from professional pocket pickers. Nat. Struct. Mol. Biol. 14, 1025-1040 (2007).
- Seet, B. T., Dikic, I., Zhou, M. M., Pawson, T. Reading protein modifications with interaction domains. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7, 473-483 (2006).
- Strahl, B. D., Allis, C. D. The language of covalent histone modifications. Nature. 403, 41-45 (2000).
- Vossenaar, E. R., Zendman, A. J., van Venrooij, W. J., Pruijn, G. J. PAD, a growing family of citrullinating enzymes: genes, features and involvement in disease. Bioessays. 25, 1106-1118 (2003).
- Gyorgy, B., Toth, E., Tarcsa, E., Falus, A., Buzas, E. I. Citrullination: a posttranslational modification in health and disease. Int. J. Biochem. Cell Biol. 38, 1662-1677 (2006).
- Nakashima, K., Hagiwara, T., Yamada, M. Nuclear localization of peptidylarginine deiminase V and histone deimination in granulocytes. J. Biol. Chem. 277, 49562-49568 (2002).
- Hagiwara, T., Hidaka, Y., Yamada, M. Deimination of histone H2A and H4 at arginine 3 in HL-60 granulocytes. 생화학. 44, 5827-5834 (2005).
- Kearney, P. L., et al. Kinetic characterization of protein arginine deiminase 4: a transcriptional corepressor implicated in the onset and progression of rheumatoid arthritis. 생화학. 44, 10570-10582 (2005).
- Christophorou, M. A., et al. Citrullination regulates pluripotency and histone H1 binding to chromatin. Nature. 507 (7490), 104-108 (2014).
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303, 1532-1535 (2004).
- Li, P., et al. PAD4 is essential for antibacterial innate immunity mediated by neutrophil extracellular traps. J. Exp. Med. 207, 1853-1862 (2010).
- Wang, Y., et al. Histone hypercitrullination mediates chromatin decondensation and neutrophil extracellular trap formation. J. Cell. Biol. 184, 205-213 (2009).
- Wang, S., Wang, Y. Peptidylarginine deiminases in citrullination, gene regulation, health and pathogenesis. Biochim. Biophys. Acta. 1829, 1126-1135 (2013).
- Trouw, L. A., Mahler, M. Closing the serological gap: promising novel biomarkers for the early diagnosis of rheumatoid arthritis. Autoimmun. Rev. 12, 318-322 (2012).
- Chang, X., Fang, K. PADI4 and tumourigenesis. Cancer Cell Int. 10, 7 (2010).
- Wang, L., Chang, X., Yuan, G., Zhao, Y., Wang, P. Expression of peptidylarginine deiminase type 4 in ovarian tumors. Int. J. Biol. Sci. 6, 454-464 (2010).
- Chang, X., et al. Investigating the pathogenic role of PADI4 in oesophageal cancer. Int. J. Biol. Sci. 7, 769-781 (2011).
- Zhang, X., et al. Genome-wide analysis reveals PADI4 cooperates with Elk-1 to activate c-Fos expression in breast cancer cells. PLoS Genet. 7, (2011).
- Tanikawa, C., et al. Regulation of histone modification and chromatin structure by the p53-PADI4 pathway. Nat. Commun. 3, 676 (2012).
- Cui, X., et al. The induction of microRNA-16 in colon cancer cells by protein arginine deiminase inhibition causes a p53-dependent cell cycle arrest. PLos One. 8, (2013).
- Jones, J. E., Causey, C. P., Knuckley, B., Slack-Noyes, J. L., Thompson, P. R. Protein arginine deiminase 4 (PAD4): Current understanding and future therapeutic potential. Curr. Opin. Drug Discov. Devel. 12, 616-627 (2009).
- Li, P., et al. Regulation of p53 target gene expression by peptidylarginine deiminase 4. Mol. Cell Biol. 28, 4745-4758 (2008).
- Wang, Y., et al. Anticancer peptidylarginine deiminase (PAD) inhibitors regulate the autophagy flux and the mammalian target of rapamycin complex 1 activity. J. Biol. Chem. 287, 25941-25953 (2012).
- Slack, J. L., Causey, C. P., Thompson, P. R. Protein arginine deiminase 4: a target for an epigenetic cancer therapy. Cell. Mol. Life Sci. 68, 709-720 (2011).
- Luo, Y., Knuckley, B., Lee, Y. H., Stallcup, M. R., Thompson, P. R. A fluoroacetamidine-based inactivator of protein arginine deiminase 4: design, synthesis, and in vitro and in vivo evaluation. J. Am. Chem. Soc. 128, 1092-1093 (2006).
- Knuckley, B., et al. Substrate specificity and kinetic studies of PADs. 생화학. 1, 4852-4863 (2010).
- Knipp, M., Vasak, M. A colorimetric 96-well microtiter plate assay for the determination of enzymatically formed citrulline. Anal. Biochem. 286, 257-264 (2000).
- Knuckley, B., et al. A fluopol-ABPP HTS assay to identify PAD inhibitors. Chem. Commun. 46, 7175-7177 (2010).
- Bicker, K. L., Subramanian, V., Chumanevich, A. A., Hofseth, L. J., Thompson, P. R. Seeing citrulline: development of a phenylglyoxal-based probe to visualize protein citrullination. J. Am. Chem. Soc. 134, 17015-17018 (2012).
- Wang, Q., Priestman, M. A., Lawrence, D. S. Monitoring of protein arginine deiminase activity by using fluorescence quenching: multicolor visualization of citrullination. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 52, 2323-2325 (2013).
- Jones, J. E., et al. Synthesis and screening of a haloacetamidine containing library to identify PAD4 selective inhibitors. ACS Chem. Biol. 7, 160-165 (2012).
- Dreyton, C. J., et al. . Optimization and characterization of a pan protein arginine deiminase (PAD) inhibitor. , (2010).
- Shimoyama, S., et al. Deimination stabilizes histone H2A/H2B dimers as revealed by electrospray ionization mass spectrometry. J. Mass Spectrom. 45, 900-908 (2010).
- Luo, Y., et al. Inhibitors and inactivators of protein arginine deiminase 4: functional and structural characterization. 생화학. 45, 11727-11736 (2006).
