De molekylära mekanismer som samordnar bildandet av hämmande GABAerga synapser under ontogenin är till stor del okända. För att studera dessa processer, har vi utvecklat en samodling modellsystem som inkorporerar embryonala mediet taggig GABAerga neuron odlade tillsammans med stabilt transfekterade humana embryonala njur-293 (HEK293) -celler som uttrycker funktionella GABA A-receptorer.
Inhibitory neurons act in the central nervous system to regulate the dynamics and spatio-temporal co-ordination of neuronal networks. GABA (γ-aminobutyric acid) is the predominant inhibitory neurotransmitter in the brain. It is released from the presynaptic terminals of inhibitory neurons within highly specialized intercellular junctions known as synapses, where it binds to GABAA receptors (GABAARs) present at the plasma membrane of the synapse-receiving, postsynaptic neurons. Activation of these GABA-gated ion channels leads to influx of chloride resulting in postsynaptic potential changes that decrease the probability that these neurons will generate action potentials.
During development, diverse types of inhibitory neurons with distinct morphological, electrophysiological and neurochemical characteristics have the ability to recognize their target neurons and form synapses which incorporate specific GABAARs subtypes. This principle of selective innervation of neuronal targets raises the question as to how the appropriate synaptic partners identify each other.
To elucidate the underlying molecular mechanisms, a novel in vitro co-culture model system was established, in which medium spiny GABAergic neurons, a highly homogenous population of neurons isolated from the embryonic striatum, were cultured with stably transfected HEK293 cell lines that express different GABAAR subtypes. Synapses form rapidly, efficiently and selectively in this system, and are easily accessible for quantification. Our results indicate that various GABAAR subtypes differ in their ability to promote synapse formation, suggesting that this reduced in vitro model system can be used to reproduce, at least in part, the in vivo conditions required for the recognition of the appropriate synaptic partners and formation of specific synapses. Here the protocols for culturing the medium spiny neurons and generating HEK293 cells lines expressing GABAARs are first described, followed by detailed instructions on how to combine these two cell types in co-culture and analyze the formation of synaptic contacts.
GABA är en av de tidigaste signalsubstanser som finns i den embryonala hjärnan, som föregår det mest rikligt förekommande excitatoriska neurotransmittorn glutamat 1. Under utvecklingen depolarizes GABA och retas omogna nervceller, spelar en viktig roll i regleringen av celltillväxt, migration och bildandet av neuronala nätverk utan att inducera excitotoxicitet. I den vuxna hjärnan, är återföring potential för GABA-A-receptorkanaler skiftas till mer negativa potentialer på grund av en minskning i den intracellulära koncentrationen av klorid. Denna förändring beror på uppreglering av kaliumklorid co-transportör (KCC2), som transporterar klorid ut ur cellen, och parallellt, nedreglering av natrium-kaliumklorid transportör (NKCC1), som har motsatt effekt 2.
I hjärnan GABA binder primärt till antingen GABA A eller GABA-B-receptorer för att mediera snabb eller långsam synaptisk hämning, respektively. GABA A Rs är en klass av receptorer som också kallas heteropentameric jonotropa eller ligandstyrda Cys-loop jonkanaler. Två molekyler av GABA krävs för aktivering av receptorn, som är permeabelt för kloridjoner, och i mindre grad, bikarbonatjoner. Ökningen av kloridkonduktans minskar effektiviteten av depolariserande, excitatoriska evenemang i aktivering av postsynaptiska neuron 3.
Strukturell mångfald av GABA A Rs har länge setts som en viktig faktor för att fastställa deras breda utbud av funktionella och farmakologiska egenskaper. Native GABA A Rs är hetero pentamererna sammansatta av subenheter med flera isoformer som klassificeras som: α (1-6), β (1-3), γ (1-3), δ, ε, π och θ 3, med en gemensam transmembrantopologin som innefattar en stor N-terminal extracellulär domän, fyra transmembrandomäner (TMS), och ett stort intracellulärt område mellan minnen 3 och 4 4. Denβ3 och γ2 subenheter är viktiga för synaptisk inhibition och organism överlevnad, eftersom möss med utslagen gen av dessa subenheter dör efter födseln 5,6. I motsats härtill individuella isoformer av α-subenheten är viktiga för funktionen av specifika synaptiska förbindelser i hjärnan associerad med olika beteenden såsom ångest, sedering, upphetsning, och andra, men inte är det, var för sig, väsentligt för livet 7-9. GABA A skivor är de viktigaste platserna i åtgärder för en mängd olika läkemedel med potent lugnande, sömnmedel, ångestdämpande och kramplösande effekter, såsom bensodiazepiner, barbiturater, neurosteroider och bedövningsmedel 7,10,11.
Synaptic GABA A Rs innehåller vanligen en γ2 subenhet, två β-subenheter (oftast β2 eller β3) och två α subenheter (α1, α2, α3 eller α5) 12,13. Den dominerande klassen av extra-synaptiska receptorer innehåller δ subenheten i kombinationmed två α-subenheter (α4 eller α6) och två β-subenheter (β2 eller β3) 14. Subcellulär lokalisering av GABA A Rs till axoner, dendriter eller soma och sätts in i plasmamembranet är beroende av förekomsten av β-subenheter 15,16. Men selektiv inkorporering av olika GABA A R subtyper i olika typer av synapser korrelerar väl med förekomsten av specifika α subenheter (α1, α2, α3 eller α5) 7,17,18. Viktigt radering av α1 och α2 subenheten hos möss orsakar ultra förändringar vid hämmande synapser 19. Detta tyder på att GABA A RS själva kan spela en direkt roll i regleringen av synaps bildning.
Bevis tyder på att GABAergic synaps utveckling är en exakt koordinerad händelseförlopp, där både neuronala mål i kontakt med olika typer av hämmande axoner och de receptorer som är grupperade påvarje klass av hämmande synaps är selektiva och funktionellt anpassade 17,20-22. Denna grundläggande princip för specificitet på GABAergiska synapser väcker frågan om hur de pre- och postsynaptiska parter erkänner varandra under inledningen av synaptiska kontakter.
In vitro co-kultur-analyser har använts framgångsrikt för att studera några av mekanismerna i synaps bildning och för att testa rollen av individuella synapsen överbryggande proteiner i denna process. Ett av de vanligaste trans synaptiska samverkande proteinkombinationer som fungerar dubbelriktat för att mediera synaps bildning och mognad, är de Neurexins (Nrxns) och Neuroliginer (NLS). Nrxns är presynaptiska proteiner som uppvisar alternativ splits inom sina laminin-neurexin-könshormonbindande proteindomäner, vilket ger upphov till många olika isoformer 23. Medan Nrxns också interagera med andra proteiner, är NLS tros vara deras allestädes närvarande postsynaptiska partners 24. Tillsammans dessa proteiner bidrar till att hålla de presynaptiska och postsynaptiska membran i nära och stela apposition 25. De två mest förekommande isoformer är NL-1 och NL-2, som är närvarande vid excitatoriska och hämmande synapser, respektive 26. En av de tidigaste co-kultur modellsystem, utformade för att studera trans synaptiska proteininteraktioner, anställd olika typer av icke-neuronala celler, oftast odödliga cellinjer såsom mänskliga embryonala Kidney (HEK) 293-celler, som överuttrycker NL- 2. När dessa celler odlades med Pontine neuroner, var en ackumulering av presynaptiska proteiner i omedelbar närhet till ytan av HEK-celler observerades, vilket indikerar bildning av synaps liknande kontakter. Tillsats av lösligt β-neurexin dessa samkulturer hämmade bildningen av kontakter, vilket tyder på att trans synaptiska interaktioner mellan Nrxns och NLS är nödvändiga för synaptisk kontakt bildning 27. Dessutom övergående uttryckav β-neurexin i COS (C V-1 (simian) i O rigin, och bär S V40 genetiskt material) celler samodlade med dissocierad hippocampus glutamaterg och GABAerga neuroner inducerad expression av den postsynaptiska protein gephryin och av GABAA-R-subenheter γ2 och α2 vid kontaktpunkter mellan dessa två celltyper 28. Ett annat exempel på en co-kultur-modellen används för att studera synaps bildning involverade HEK293-celler, transient transfekterade med GABA A R subenheter α2 / β3 / γ2 och NL-2, och en blandad population av hypotalamus nervceller 29. Denna studie drog slutsatsen att uttryck av NL-2 är ett absolut krav för bildning av hämmande synapser.
Men i den aktuella studien co-kultur, stabilt transfekterad α1 / β2 / γ2 GABA A skivor i HEK293-celler visade sig vara tillräcklig för att inducera funktionella synapser när samodlade med GABAergiska Medium taggiga nervceller, utan behov av ytterligare trans synaptiska eller postsynaptiska vidhäftningsproteiner. Dock var en framstående ökning av synaps bildning och styrka observerades när NL-2 samuttryckas med GABA A Rs 30. Detta tyder på att detta samarbete kultur modellsystem har fördelar jämfört med tidigare beskrivna modellsystem, de flesta uppenbarligen en ökad känslighet och tillförlitlighet synaptiska kontaktdetektering. Två viktiga faktorer som bidrar till den allmänna förbättringen av detektion av synaptiska kontakter är: i) Användningen av stabilt transfekterade HEK293 cellinjer med hög och jämn uttryck av GABA A R subenheter på ytan av enskilda celler. Denna konsekvens underlättar kvantitativa jämförelser mellan olika sam-odlingsbetingelser. ii) Användning av en ren population av GABAergiska medel taggiga nervceller odlas från embryonala striatum 31 avlägsnar komplikationer och oklarheter till följd av användning av blandade neuronala populationer och allows, till exempel val av de lämpligaste postsynaptiska GABA A R typer som kan jämföras med varandra under synaps bildning.
Bildning av synapser tros involvera många trans synaptiska signaler inom pre- och postsynaptiska cellvidhäftningskomplex. På grund av den dubbelriktade karaktär synaptisk signalering och det stora antalet celladhesionsmolekyler, är det svårt att identifiera nyckelkomponenter är inblandade i synaps bildning. Således transfektera en enda celladhesionsprotein till en icke-neuronal cell (i detta fall, de två mest förekommande postsynaptiska mål för GABAergiska medel taggiga nervceller in vivo, α1 / β2 / γ2 eller α1 / β3 / γ2 GABA A Rs 32) kraftigt minskar komplexiteten i trans synaptiska signaler tillgängliga vid postsynaptiska ytan och ger exakt kvantitativ analys av effekten av detta protein för att främja synaps bildning.
Även om detta protokoll är inte tekniskt svårt att genomföra, det finns flera viktiga steg som måste följas för att uppnå den mest exakta och repeterbara co-kulturanalyser. För det första måste odlade medel taggiga nervceller seedas på en optimal täthet. Om seedade alltför glest, nervceller tenderar att utvecklas mycket långsamt och överlevnad är kraftigt reducerad. Å andra sidan, om ympades alltför tätt, nervceller tenderar att aggregera som äventyrar analys av kontakterna med HEK293-celler. För det andra är det rekommenderat att transient uttrycka en fluorescerande reporter, GFP eller mCherry i HEK293-celler som stabilt uttrycker GABA A Rs före Platting dem i co-kultur. Detta möjliggör tillförlitlig erkännande av HEK293-celler, som kan äventyras av likhet i form och storlek mellan dessa celler och sällsynta överlevande glia cell i neuronala kulturer. För att uppnå en effektiv transfektion med GFP eller mCherry cDNA, HEK293-cellinjer måste vara i den exponentiella tillväxtfasen ochympades vid lämplig densitet i 6-brunnars plattor. Gles sådd följt av transfektion orsakar cellerna att växa dåligt, medan över-seeding förhindrar cellerna från att ta upp cDNA. Idealt bör cellerna såddes så att de är mellan 70 till 90% sammanflytande på dagen för transfektion. För det tredje måste transfektionen optimeras för varje cellinje som används, eftersom vissa cellinjer är mer känsliga än de andra. Detta beror på att konstitutivt GABAA-R-expression i HEK293-celler reducerar cellöverlevnad och förmågan hos celler att återhämta sig efter transfektion. Dessutom överlevnad beror på typen av GABA A-Rs uttryckt i HEK293-celler, med en del cellinjer är betydligt mer känsliga än de andra. Transfektion med hjälp av liposomalt reagens är en optimal metod för att uttrycka främmande proteiner i snabbväxande cellinjer, som ger både hög transfektionseffektivitet och uttrycksnivå. Emellertid orsakar detta reagens för mycket skada för att långsamt växande cellinjer, försom vi använder regelbundet en icke-liposomalt transfektionsreagens. Denna fungerar på ett liknande sätt till den liposomala reagenset men mängden av DNA som krävs för effektiv transfektion har minskat avsevärt. Detta medger större cellöverlevnad (ungefär 80 till 90% jämfört med 60% med användning av liposomalt reagens) men med lägre transfektionseffektivitet (60%). Slutligen har antalet kontroll HEK293 eller α1 / β2 / γ2 HEK293 uttryckande celler läggs till neuronala kulturer behöver optimeras. Lägga för få celler äventyrar framgångsrik analys av kontakter mellan HEK293-celler och neuroner, eftersom de blir mycket sällsynt. Omvänt, lägga alltför många HEK293-celler orsakar nervcellsdöd inom några timmar.
Embryonala medel taggig neuron kulturer bör helst beredas genom att använda striatal vävnad dissekerades från embryonala ålder 15 – 17. Dock händer det ofta att embryon är något yngre eller äldre än den optimala åldern. I detta fall är antalet neuroner inokuleras i ett odlings kommerbehöva varieras. Vävnad som är yngre än E15 kan behöva såddes vid en något lägre densitet, medan vävnaden som är äldre än E17 kan behöva såddes vid en högre densitet, för att möjliggöra en optimal cellöverlevnad. Vidare kan cytosinarabinosid (Ara-C) måste läggas till äldre kulturer för att förhindra tillväxt av glia, vilket är mer rikligt förekommande i äldre vävnad.
När man skapar samkulturer, är det viktigt att plätera det optimerade antalet transfekterade HEK293 eller α1 / β2 / γ2 HEK293-uttryckande celler, såsom nämnts ovan. Emellertid kan det vara nödvändigt att bestämma detta för varje enskild cell-linje, på grund av skillnader i deras överlevnad. Normalt 30.000 celler i en maximal volym av 50 ul bör läggas till varje brunn i en 24-bra maträtt, som redan innehåller 500 l av neuronala odlingsmedium, eftersom det säkerställer att rade neuronala mediet inte späds för mycket och att de villkor inom varje brunn förbli ganska konstant, t.ex. </em> Koncentrationen av tillväxtfaktorer. Lägga volymer som är större än 50 pl till varje brunn skulle generellt döda nervceller.
En av de största nackdelarna med co-kultur teknik är att de neuronala kulturer skapas från dissocierade celler odlas som ett monolager, vilket innebär att nervceller har tagits bort från sin normala mikro och inte kan styrka sin normala anatomiska organisation. Därför att de saknar lämpliga anslutningar, ingångar och utsöndrade molekyler från andra celler som kan påverka de inledande faserna av synaps utveckling. Exempelvis in vivo medel taggiga neuroner är tätt innerveras av glutamaterga insignaler från cortex, thalamus och andra hjärnregioner 34, emellertid, i våra neuronala kulturer glutamaterga synapser bildar inte eftersom dessa ingångar är skadad under dissektion av striatal vävnad. Så avsaknaden av funktionella glutamaterg synapser i odlade medel taggiga nervceller AFFekter deras förmåga att bilda GABAergic synapser med varandra och / eller HEK293-celler som uttrycker GABA ^ Rs är fortfarande en öppen fråga. Denna fråga kan lätt åtgärdas genom odling medel taggiga nervceller tillsammans med kortikala glutamaterga neuroner tillåter därmed dem att bilda funktionella synapser 35 före tillsättningen av HEK293-celler. Ett alternativt tillvägagångssätt skulle vara att utforma en samarbetskultur modellsystem baserat på organotypiska slice kulturer som behåller en del av cytoarchitecture som kan vara viktiga för mognad och synaps bildning. Men organotypiska slice kulturer har tät och heterogena neuropil som kan äventyra analys här. En annan viktig nackdel med användning av sam-odlingsanalyser är att GABAA-Rs uttryckt vid ytan av HEK293-celler som inte är klustrade som de är i neuroner, även om detta inte verkar vara nödvändig för synaps bildning ges en tillräckligt hög ytexpression 30. Till exempel, i den rOdent hjärna och i hippocampus kulturer är α1 GABA A R-subenhet finns i de flesta GABAerga synapser på alla postsynaptiska områden av pyramidala celler. Dock är α2 specifikt belägen i en delmängd av synapser på somata och dendriter men höganrikat i axonet inledande segmentet, vilket framgår av immunofluorescens och elektronmikroskopi 36. Med tanke på att synaps bildning i samkulturer fortfarande tillförlitligt kan upptäckas och analyseras 30, tyder detta på att tätheten av GABA A R på cellytan hos HEK293 celler kan likna, eller till och med högre än densiteten hos dessa receptorer i synaptic kluster i nervceller. Detta kan förklara, åtminstone delvis, varför synaptiska vidhäftningsproteiner, såsom neuroligin och postsynaptiska densitetsproteiner, såsom gephyrin, är inte nödvändiga för synaps bildning i samkulturer, om de på lämpligt sätt sammanfogade GABA A Rs är närvarande vid tillräcklig densitet.
Det är väl dokumenterat att GABA A Rs är strukturellt och funktionellt heterogen och att receptorsubenhet kompositionen bestämmer deras subcellulära lokalisering och farmakologiska egenskaper. Till exempel är inkorporering av de två subenheterna känt för att vara en förutsättning för den synaptiska lokalisering av GABA A-Rs medan subenheten är nästan uteslutande närvarande i extrasynaptic GABA A Rs. Receptorerna som innehåller endast αβ kombinationer också tänkt att vara övervägande lokaliserad till extrasynaptic domänerna 12- 14. Huruvida denna specificitet bibehålls i vår samodlingssystemet kan lätt testas genom transient transfektion 2 eller subenhet cDNA i HEK293 cellinjer stabilt uttrycker α och β-subenheter, innan du lägger dem till neuronala kulturer. Våra preliminära experiment med användning av denna metod har föreslagit att synaptiska kontakter bildas lätt endast i närvaro av 2-subenheten, vilket indikerar att den specificity observerats in vivo är troligen bevaras in vitro (data ej visade).
Dessutom är GABA A skivor som innehåller olika α subenheter selektivt lokaliserad till synaptiska kontakter som bildas med specifika typer av presynaptiska neuroner. Till exempel i globus pallidus, den α1-GABA A Rs allmänhet finns på striatopallidal (str-GP) och palliopallidal (GP-GP) synapser, som ligger på dendriter och somatiska regioner av medel taggiga nervceller, respektive. De α3-GABA A R låg i perisomatic regioner av medel taggiga nervceller och kontaktas av lokala GP axon säkerheter, medan α2-GABA A R låg på distala dendriter av dessa neuroner och kontaktade främst av insatsvaror från striatum 32. Uttryck av specifika α subenheter i olika typer av synapser och på olika neuronala fack har också påvisats i andra områden i hjärnan, såsom Hippocampus 21 och neocortex 18,20. Dessa fynd ger upphov till frågan om hur de specifika hämmande synapser bildas i hjärnan. Har vidhäftningen av en viss typ av presynaptiska terminal framkalla det införs särskilda GABA A R subtyper i kontaktpunkterna? Är receptorerna smugglas till specifika subcellulära platser enligt deras subenhet sammansättning, där deras plasmamembran insättning är en förutsättning för vidhäftning av axonal terminaler specifika ursprung? Hittills har dessa frågor förblir obesvarade. Användningen av reducerade modellsystem såsom samodlingssystemet modellsystem, tillåter oss att börja svara denna komplicerade frågor, eftersom systemet är lätta att transfektion av DNA-konstruktioner och tillämpning av reagens och, viktigare, är den lämplig för levande cell imaging analys 30. Således, med hjälp av denna modell system som vi kan börja testa rollen av enskilda molekyler, inklusive olika typer av GABA A Rs, vetn att närvara vid synaptiska kontakter. En annan fördel är att synapser i detta modellsystem formulär snabbt, inom några minuter till timmar, minska varaktigheten av experiment. Liknande samodling modellsystem har med framgång använts i det förflutna för att screena för de nya synaptogenic molekylerna 27,37,38.
Att förstå hur det centrala nervsystemet utvecklas, mognar och bildar kopplingar mellan nervceller så intrikat att kontrollera, till exempel, beteende eller kognition, är av grundläggande betydelse. Denna avlägsna mål kan bara uppnås genom att avgränsa de molekylära mekanismer som styr de enskilda stegen i erkännande och cell till cell kommunikation under utveckling. På grund av ren komplexitet, kan de molekylära detaljerna i dessa multipla cellulära interaktioner närvarande studeras med precision endast i minskade system. Emellertid är förmågan att öka komplexiteten i dessa system genom att uttrycka multipla kombinationer av proteiner och studerar hurde interagerar har vissa fördelar i jämförelse med till exempel genetiska radering metoder. Detta beror på att den korrekta tolkningen av effekterna av en enda gen deletion ofta äventyras av förändringar i samband med kompensationsmekanismer maskera effekterna av original skador, särskilt i den växande hjärnan. Den enkla men informativa co-kultur teknik som beskrivs här har gjort en upptäckt av den strukturella rollen av GABA A skivor i synaps bildning och öppnade en möjlighet att undersöka hur GABA A RS och celladhesionsmolekyler och / eller synaptiska matris proteiner interagerar med varandra under synaptogenes. Synaptic matrixproteiner är av särskilt intresse med tanke på att de har nyligen visat sig spela en viktig roll i glutamaterg synaps bildning 39. Vidareutveckling av samarbete odlingsmodeller är viktiga eftersom de har potential att förbättra vår kunskap om de molekylära mekanismer som styr den "normala &# 8217; hjärnans utveckling och därmed öka vår förståelse för hur dessa mekanismer förändras i många nervsystemets sjukdomar, såsom epilepsi, schizofreni, autism och många andra.
The authors have nothing to disclose.
Vi vill tacka för det ekonomiska stödet från MRC Storbritannien (G0800498). Vi vill också tacka professor JM Fritschy, universitetet i Zürich, för att förse GABA A -R subenhet specifik γ2 antikropp och professor R. Harvey, UCL School of Pharmacy, för att tillhandahålla den pcDNA 3.1 (+) expressionsvektorer innehållande antibiotikaresistens gener för produktion av stabilt transfekterade HEK293 cellinjer.
Name | Company/Individual | Catalog Number | Comments |
DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Serum) | Life Technologies | 11960-044 | Warm in water bath at 37 ° С before use |
L-Glutamine | Life Technologies | 25030-024 | |
Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15070-063 | Danger: irritant |
FBS (Fetal Bovine Serum) | Life Technologies | 10106-169 | |
Neurobasal | Life Technologies | 21103-049 | Warm in water bath at 37 ° С before use |
B27 Supplement | Life Technologies | 17504-044 | |
Glucose | Sigma-Aldrich | G8769 | |
HBSS (10X) | Life Technologies | 14180-046 | |
HEPES (1M) | Life Technologies | 15630-056 | |
PBS (1X) | Life Technologies | 10010-031 | |
pcDNATM 3.1 (+) Mammalian Expression Vector (Geneticin-selection) | Life Technologies | V790-20 | |
pcDNATM 3.1 (+) Mammalian Expression Vector (Zeocin-selection) | Life Technologies | V860-20 | |
pcDNATM 3.1 (+) Mammalian Expression Vector (Hygromycin-selection) | Life Technologies | V870-20 | |
Stable HEKα1β2γ2 line | Sanofi-Synthelabo, Paris | ||
Poly-D-lysine | Sigma-Aldrich | P1149 | |
G418 disulfate salt (Geneticin) | Sigma-Aldrich | G5013 | Danger: irritant |
Phleomycin D1 (Zeocin) | Life Technologies | R25001 | |
Hygromycin B | Life Technologies | 10687-010 | Danger: toxic, irritant and corrosive |
Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300-054 | Warm in water bath at 37 ° С before use Danger: Irritant. |
Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P6282 | |
Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | |
100 μm Nylon Cell Strainer | VWR | 734-0004 | |
Cytosine β-D-arabinofuranoside (Ara-C) | Sigma-Aldrich | C1768 | Danger: Irritant |
Chelating agent (Versene) | Life Technologies | 15040-033 | |
liposomal transfection reagent (Lipofectamine LTX) with liposomal transfection buffering reagent (PLUS reagent). | Life Technologies | 15338-100 | Alternative transfection method: Effectene Reagent |
Non-liposomal transfection reagent (Effectene reagent) | Qiagen | 301425 | |
Reduced serum medium (Opti-MEM) | Life Technologies | 11058-021 | |
Mouse anti-Synaptotagmin antibody conjugated to Cy5 | Synaptic Systems | 105311C5 | |
Neurobasal A | Life Technologies | 10888-022 | |
Sodium Chloride (NaCl) | VWR | 27810.364 | |
Glycine | Sigma-Aldrich | G1726 | |
BSA (Bovine Serum Albumin) | Sigma-Aldrich | A3294 | |
Guinea pig anti-γ2 GABAA receptor antibody | Prof. Jean Marc Fritschy | N/A | |
(Institute of Zurich, Switzerland) Fritschy, J.M and Mohler, H. | |||
J. Comp. Neurol. 359 (1) 154–194 (1995). | |||
Triton X-100 | Promega | H5141 | |
Mouse anti-Glutamate Decarboxylase (GAD)65 antibody | Merck Millipore | MAB351 | |
Mouse anti-synapsin antibody | Synaptic Systems | 106-011 | |
Mouse anti-β2/3 antibody (BD17) | Merck Millipore | MAB341 | |
Rabbit anti-α1 GABAA receptor antibody | Professor Anne Stephenson | N/A | |
(UCL School of Pharmacy, London) FA Stephenson et al., J. Comp. Neurol.416 (2) 158-172. | |||
Goat anti-guinea pig conjugated to Cy5 antibody | Merck Millipore | AP1085 | |
Goat anti-mouse Alexa Fluor 488 antibody | Merck Millipore | AP124S | |
Goat anti-mouse Alexa Fluor 405 antibody | Life Technologies | A31553 | |
Goat anti-mouse Alexa Fluor 555 antibody | Life Technologies | A21422 | |
Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488 antibody | Life Technologies | A11008 | |
Mounting reagent (Prolong Gold) | Life Technologies | P36930 | Use at room temperature |