Analyse in vitro de la réponse immunitaire cellulaire Myd88 médiation au virus du Nil occidental souche mutante Infection
Summary
Two flow cytometry-based methods – an in vitro T cell priming assay and intracellular cytokine staining were utilized to measure antigen presenting capacity of dendritic cells and antigen-specific T cell responses to a West Nile virus mutant infection in mice.
Abstract
Un virus atténué du Nil occidental (VNO), un non structurale (NS) 4B-P38G mutant, induite par les cytokines supérieur innée et réponses des lymphocytes T de type sauvage VNO chez les souris. Récemment, facteur de différenciation myéloïde 88 (MyD88) la signalisation se est avérée importante pour l'amorçage de cellules T initiale et le développement des cellules T mémoire pendant VNO NS4B-P38G infection mutant. Dans cette étude, deux méthodes de flux basés cytométrie– in vitro des cellules T dosage dans l'amorçage et une cytokine coloration intracellulaire (ICS) – ont été utilisées pour évaluer les cellules dendritiques (CD) et les fonctions des cellules T. Dans la cellule T amorçage dosage, la prolifération cellulaire a été analysée par cytométrie de flux après co-culture de DC par les deux groupes de souris avec de l'ester de succinimidyle de carboxyfluorescéine (CFSE) – marqué les cellules de souris transgéniques OTII T CD4 +. Cette approche a fourni une détermination précise du pourcentage de la prolifération des cellules T CD4 + est nettement améliorée avec sensibilité globale de la traditional dosages avec des réactifs radioactifs. Système de tube de microcentrifugation a été utilisé dans les deux procédés de culture de cellules et une coloration de la cytokine protocole ICS. Par rapport au système traditionnel à base de plaque de culture de tissu, cette procédure modifiée était plus facile à réaliser au niveau de la prévention des risques biotechnologiques (BL) 3 des installations. En outre, les cellules infectées WNV- ont été traités avec du paraformaldéhyde dans les deux essais, ce qui a permis une analyse plus poussée en dehors des installations BL3. Dans l'ensemble, ces tests in vitro immunologiques peuvent être utilisés pour évaluer efficacement des réponses immunitaires à médiation cellulaire au cours de l'infection par le VNO.
Introduction
Le virus du Nil occidental (VNO), un neurotrope, plus-détectées flavivirus, est une menace pour la santé publique émergents. Actuellement, aucun vaccin ont été approuvés pour usage humain 1. Une souche atténuée VNO, qui a une substitution P38G dans le non structurale (NS) protéine 4B, est connu pour induire aucune létalité chez les souris, mais supérieur cytokines innées et les réponses des lymphocytes T chez les souris de type sauvage que le VNO NY99 souche 2. Souris immunisées avec le mutant NS4B-P38G ont tous été protégés contre un défi secondaire avec de type sauvage létale VNO. Ceci suggère que le mutant NS4B-P38G a des caractéristiques appropriées pour un candidat vaccin idéal. Les mécanismes par lesquels le mutant NS4B-P38G induit haute immunité adaptative de protection ne sont pas encore clairement compris. Toll-like récepteurs (TLR), qui reconnaissent des motifs moléculaires associés à des pathogènes, jouent un rôle essentiel dans le déclenchement de l'immunité innée à l'infection virale. La voie de signalisation de TLR de base utilise réponse différenciation myéloïde primaire geNE 88 (MyD88) comme carte principale 3,4. Dans une étude récente, la signalisation MyD88 a été montré à jouer un rôle important dans le développement de l'immunité à médiation cellulaire au cours VNO NS4B- P38G infection chez la souris mutante 5. Cellules dendritiques (CD) sont une des plus importantes cellules présentatrices d'antigène présentant la capacité unique d'initier les réponses des cellules T primaires lors de l'infection virale 6,7. Lymphocytes T CD4 + et CD8 + contribuent tous deux à l'immunité protectrice de longue durée et sont importants pour la survie de l'hôte après-type sauvage infection par le VNO 8,9. Deux dosages immunologiques ont été utilisés dans cette étude pour évaluer les fonctions de ces cellules chez les souris mutantes infecté NS4B-P38G.
Tout d'abord, un test d'amorçage de cellules T in vitro a été utilisé pour comparer la capacité de présentation antigénique des CD de type sauvage du VNO-infectés et MyD88 – / – souris. Pour augmenter la sensibilité du test, naïfs CD4 <sup> + cellules T ont été isolés à partir de OTII souris transgéniques, qui expriment une spécifique Vα2 / Vβ5 TCR pour l'ovalbumine de poulet (OVA) peptide 323 – ont été purifiés 339. PED de souris infectées par le VNO, et co-cultivées avec carboxyfluorescéine succinimidyl pâques (CFSE ) marqué à des cellules T CD4 + en présence de peptide OVA. Après 5 jours de co-culture, les cellules ont été récoltées et fixées avec du paraformaldehyde (PFA) et analysées par cytométrie en flux. Des dosages de prolifération ont été traditionnellement réalisée par incorporation de 5-bromo-2'-désoxyuridine (BrdU) ou désoxyriboside de thymine tritiée (3 HTdr) 10. Néanmoins, ces tests sont soit radioactifs et / ou dans le besoin d'équipements spéciaux au niveau de biosécurité (BL) 3 des installations, où des études de VNO sont menées. L'analyse par cytométrie de flux de la prolifération des lymphocytes par division par deux en série de l'intensité de fluorescence du colorant vital CFSE est devenue plus couramment utilisé dans des essais immunologiques comme le colorant est plus stableet incorporé uniformément dans les cellules, facilement détectée par cytométrie de flux, et est non-radioactif 11. L'essai a également la possibilité d'évaluer le nombre de divisions cellulaires. Un avantage majeur de l'utilisation de ce test dans les études VNO est que la fixation des cellules infectées avec 1-2% PFA pourrait inactiver VNO 12, ce qui permettra l'acquisition de l'échantillon avec un cytomètre de flux dans un laboratoire de BL2.
Ensuite, une procédure coloration de cytokine intracellulaire modifié (ICS) a été utilisé pour étudier le rôle de signalisation MyD88 dans la régulation de réponses des lymphocytes T spécifiques du VNO chez les souris mutantes infectées NS4B-P38G. Dans ce dosage, les splénocytes isolés à partir de souris infectées ont été traitées in vitro avec des peptides spécifiques VNO. Bréfeldine A a été ajouté à retenir les cytokines dans la cellule. Après 5 heures d'incubation, les cellules ont été récoltées, lavées et colorées pour des sous-ensembles de cellules T. Les cellules ont ensuite été fixées dans PFA, perméabilisées et colorées pour l'interféron (IFN) -γ et analysées par cytométrie en flux.Comme avec d'autres dosage à base de cytométrie en flux, une fois que les cellules sont traitées avec un tampon de fixation et perméabilisation contenant PFA, les échantillons infectés peuvent être transférés à un laboratoire de BL2 pour un traitement ultérieur et d'analyse. Dans plusieurs études publiées, nous avons utilisé ICS pour mesurer les fonctions T effectrices de cellules chez des souris infectées par le VNO 13,14. Bien qu'il soit bien établi, un inconvénient majeur de ce test est que la procédure est très longue et pourrait être plus de temps lorsqu'il est effectué à l'intérieur des installations BL3. Ici, un procédé à base d'ICS tube de micro-centrifugeuse de se est révélé être plus facile, plus facile de procéder et moins de temps lorsqu'il est effectué dans un laboratoire BL3.
Protocol
Representative Results
Discussion
VNO est un agent pathogène BL3. En raison des règlements de sécurité, les dosages immunologiques avec des échantillons de VNO-infectés sont souvent limités par la disponibilité de l'équipement au BL3 installations ou plus longue et fastidieuse à effectuer. Dans une étude récente, nous avons utilisé deux méthodes basées sur la cytométrie de flux pour étudier les réponses immunitaires à médiation cellulaire lors de l'infection par le VNO 5. Dans les deux essais, les cellules infecté…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by NIH grants to T.W. (R01AI072060 and R01AI099123). G. Xie was supported by a Sealy Center for Vaccine Development Predoctoral Fellowship. We thank Dr. Richard Flavell (Howard Hughes Medical Institute, Yale University School of Medicine, New Haven) and Dr. Shizuo Akira (Osaka University, Japan) for providing the MyD88–/– mice and Dr. Y Cong (UTMB, Galveston) for providing OTII transgenic mice.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| RPMI 1640 | Invitrogen | 11875 | warm up at 37C |
| anti-CD11c magnetic beads | Miltenyi Biotec | 130-052-001 | follow the manufacturer’s instructions |
| anti-CD4 magnetic beads | Miltenyi Biotec | 130-095-248 | follow the manufacturer’s instructions |
| CFSE | Invitrogen | C34554 | |
| OVA residue 323-339 | Genscript Corporation | RP10610 | |
| Peptides | Proimmune | PC0AD-D | |
| Brefeldin A solution | BD Bioscience | 555029 | |
| Mouse Fc Blocker | e-Bioscience | 14-0161-85 | |
| APC-conjugated CD4 | e-Bioscience | 17-0041-81 | |
| FITC-conjugated CD8 | e- bioscience | 11-0081-82 | |
| Fixation/Permeabilization Solution | BD- Bioscience | 554722 | |
| Permeabilization/wash buffer | BD- Bioscience | 554723 | |
| anti-IFNg-PE | e-Bioscience | 12-7311-82 | |
| Accuri flow cytometer | BD Bioscience |
References
- Campbell, G. L., Marfin, A. A., Lanciotti, R. S., Gubler, D. J. West Nile virus. Lancet Infect. Dis. 2, 519-529 (2002).
- Welte, T., et al. Immune responses to an attenuated West Nile virus NS4B-P38G mutant strain. Vaccine. 29, 4853-4861 (2011).
- Iwasaki, A., Medzhitov, R. Toll-like receptor control of the adaptive immune responses. Nat. Immunol. 5, 987-995 (2004).
- Akira, S., Hemmi, H. Recognition of pathogen-associated molecular patterns by TLR family. Immunol. Lett. 85, 85-95 (2003).
- Xie, G., et al. A West Nile virus NS4B-P38G mutant strain induces adaptive immunity via TLR7-MyD88-dependent and independent signaling pathways. Vaccine. 31 (38), 4143-4151 (2013).
- Fang, H., et al. gammadelta T cells promote the maturation of dendritic cells during West Nile virus infection. FEMS Immunol. Med. Microbiol. 59, 71-80 (2010).
- Silva, M. C., Guerrero-Plata, A., Gilfoy, F. D., Garofalo, R. P., Mason, P. W. Differential activation of human monocyte-derived and plasmacytoid dendritic cells by West Nile virus generated in different host cells. J. Virol. 81, 13640-13648 (2007).
- Shrestha, B., Samuel, M. A., Diamond, M. S. CD8+ T Cells Require Perforin To Clear West Nile Virus from Infected Neurons. J. Virol. 80, 119-129 (2006).
- Wang, Y., Lobigs, M., Lee, E., Mullbacher, A. CD8+ T cells mediate recovery and immunopathology in West Nile virus encephalitis. J. Virol. 77, 13323-13334 (2003).
- Plebanski, M., Katsara, M., Sheng, K. C., Xiang, S. D., Apostolopoulos, V. Methods to measure T-cell responses. Expert Rev. Vaccines. 9, 595-600 (2010).
- Lyons, A. B. Analysing cell division in vivo and in vitro using flow cytometric measurement of CFSE dye dilution. J. Immunol. Methods. 243, 147-154 (2000).
- Kraus, A. A., Priemer, C., Heider, H., Kruger, D. H., Ulrich, R. Inactivation of Hantaan virus-containing samples for subsequent investigations outside biosafety level 3 facilities. Intervirology. 48, 255-261 (2005).
- Saxena, V., et al. A hamster-derived west nile virus isolate induces persistent renal infection in mice. PLoS Negl. Trop. Dis. 7, 2275 (2013).
- Welte, T., et al. Vgamma4+ T cells regulate host immune response to West Nile virus infection. FEMS Immunol. Med. Microbiol. 63, 183-192 (2011).
