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방법 논문

고해상도 전자 현미경 헬리코박터 파이로리 CAG 유형 IV 분비 시스템 필리

15.4K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/52122

⸱

2014년 11월 21일

 ,  , 
1Department of Medicine - Division of Infectious Diseases, Vanderbilt University School of Medicine, 2Tennessee Valley Healthcare Systems, U. S. Dept. of Veterans Affairs

이 논문에서

요약

여기에서는 Cag Type IV 분비 시스템(Cag-T4SS)으로 알려진 발암성 박테리아 소기관을 시각화하는 방법을 설명합니다. 우리는 Cag-T4SS가 다양한 철 가용성 조건에 반응하여 H. pylori의 표면에서 차등적으로 생성된다는 것을 발견했습니다.

초록

Helicobacter pylori는 인간 인구의 절반의 인간 위 틈새에 서식하는 나선형 모양의 그람 음성 박테리아입니다1,2. 헬리코박터 파일로리균은 위암의 주요 원인이며, 전 세계적으로 암 관련 사망의 두 번째 주요 원인입니다3. 위 질환의 위험 증가와 관련이 있는 독성 인자 중 하나는 H. pylori의 염색체 내 40kb 영역인 Cag-병원성 섬으로, IV형 분비 시스템과 동족 효과기 분자인 CagA4,5를 암호화합니다. Cag-T4SS는 CagA와 펩티도글리칸을 숙주 상피 세포로 전위시키는 역할을 합니다5,6. Cag-T4SS의 활성은 사이토카인 발현의 상향 조절, 전염증 경로의 활성화, 세포골격 리모델링, 발암성 세포 신호 네트워크의 유도 등 숙주 세포 생물학에 수많은 변화를 일으킵니다5-8. Cag-T4SS는 내막과 외막에 걸쳐 세포에서 세포 외 공간으로 바깥쪽으로 확장되는 하위 조립 구성 요소로 구성된 고분자 기계입니다. Cag-T4SS의 세포외 부분은 "필루스(pilus)"5로 지칭됩니다. 수많은 연구에서 Cag-T4SS pili가 숙주-병원체 계면에서 형성된다는 것이 입증되었습니다9,10. 그러나 이 중요한 세포 기관의 생물 발생을 조절하는 환경적 특징은 대체로 모호한 상태로 남아 있습니다. 최근에 우리는 철분 가용성이 낮은 조건이 Cag-T4SS 활성과 pilus 생물 발생을 증가시켰다고 보고했습니다. 여기에서는 인간 위 상피 세포와 공동 배양하기 전에 다양한 철 가용성 조건에서 H. pylori를 성장시키기 위한 최적화된 프로토콜을 제시합니다. 또한, 우리는 고해상도 주사 전자 현미경 분석을 통해 철 제한 조건에서 나타나는 hyper-piliated 표현형의 시각화를 위한 포괄적인 프로토콜을 제시합니다.

서론

H. pylori 감염은 위암의 중요한 위험 인자입니다1. 그러나 질병의 결과는 다양하며 숙주 유전학, 헬리코박터 파일로리 균주의 유전적 다양성, 숙주 식단과 같은 환경적 요소와 같은 수많은 요인에 따라 달라진다11. 이전 보고에서는 헬리코박터 파일로리(H. pylori) 감염, 철분 결핍(혈중 페리틴 및 헤모글로빈 농도 감소로 측정), IL-8 분비를 포함한 전염증성 사이토카인 생성 증가 사이에 상관관계가 존재하며, 이는 궁극적으로 위질환 진행을 증가시킨다고 밝혔다12. 급성 헬리코박터 파일로리균 감염은 또한 숙주의 철분 흡수 능력을 손상시키고 궁극적으로 철의 항상성에 변화를 일으키는 저염소수증(hypochlorhydria)과 관련이 있다13. 이러한 임상 결과는 가스 틈새 내 철분 가용성이 질병 결과에 중요한 요인이 될 수 있음을 시사합니다. 실제로, 헬리코박터 파일로리균 감염에 대한 동물 모델은 적은 식이 철분 섭취가 위장 질환을 악화시킨다는 것을 입증했다14. 이 동물의 철분 수치가 감소하면 H. pylori가 박테리아 복제에 필요한 철을 얻기 위해 철 획득 반응을 유도해야 합니다. H. pylori는 숙주 세포 내의 철 이동을 교란하여 CagA 의존성 방식으로 박테리아 복제를 촉진하는 능력을 가지고 있습니다15. 흥미롭게도, cag-병원성 섬은 철 반응성 전사 인자 Fur16,17에 의해 조절되는 것으로 나타났습니다. 또한 Cag+ 균주는 염증 증가 및 암과 같은 위장 질환과 관련이 있습니다1. 이러한 발견은 H. pylori가 철이 고갈된 환경에 있는 숙주 세포에서 철을 얻기 위해 Cag-T4SS 발현을 변경하여 질병 결과를 악화시키는 모델을 뒷받침합니다.

염증과 이환율을 증가시키는 두 가지 요인은 전능신전능신전(CAG) 발현과 낮은 식이 철분 섭취입니다. 이러한 사실은 철분 가용성이 감소하면 숙주 병원체 계면에서 Cag-T4SS pili 생성이 증가하여 위질환이 악화된다는 가설을 뒷받침합니다11-14. 이 원고에 제공된 방법의 목표는 Cag-T4SS pilus biogenesis의 조절에서 미량 영양소 철의 역할을 확립하는 것입니다. 이전 연구에서는 Cag-T4SS 발현의 철 의존적 증가를 관찰하기 위해 두 가지 접근 방식을 사용했습니다. 첫째, 고철분 및 저철분 식단을 섭취한 동물의 산출 균주를 분석한 결과, 저철분 식단 산출 균주가 고철분 식단 균주보다 더 많은 Cag-T4SS pili를 생성한다는 사실이 밝혀졌다14. 둘째, 철이 풍부한 조건에서 H. pylori 7.13 균주를 시험관 내에서 성장시키면 필리 형성이 감소하는 반면 철 킬레이터가 있는 상태에서 성장한 세포는 훨씬 더 많은 필리를 생성했습니다.

자사는 Cag-T4SS 필리 표현형의 철 의존성 조절을 지속적으로 조사해 왔으며 추가 헬리코박터 파일로리 균주인 PMSS1에 대해 수행된 다음과 같은 최적화된 프로토콜 및 대표적인 결과를 제공합니다. 이 기술 개발의 근거는 철 제한 조건에서 증가된 Cag-T4SS 활성을 Cag-T4SS 필루스 형성 증가와 연관시키는 것이었습니다. 이 기술의 광범위한 의미와 사용은 Cag-T4SS pili의 생산을 증가시키는 최적화된 배양 조건을 제공할 것입니다. 이 분석은 이 중요한 박테리아 표면 특징을 농축하여 Cag-T4SS의 조성 및 구조를 결정하려는 연구자에게 유용할 것입니다. 전계 방출 총 전자 현미경에 의한 시료 준비 및 시각화는 Cag-T4SS를 시각화하기 위한 광학 현미경 방법과 같은 대체 기술에 비해 많은 이점이 있으며 이 소기관10의 조절을 연구하는 데 관심이 있는 연구자에게 적합합니다.

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프로토콜

1. H. 인간의 위 상피 세포와 철 가용성 및 공동 문화의 다양한 조건에서 균 성장

  1. H.를 선택 이러한 연구에 대한 파이로리 스트레인 PMSS1 그것이 그대로 CAG 병원성 아일랜드를 가지며 작동 타입 IV 분비 시스템을 표현하기 때문이다. 또한 음성 대조군으로 동질 케이지 돌연변이 (PMSSI Δ 케이지)를 사용합니다. 5 % CO 2 존재하에 37 ° C에서 24 시간 동안 5 % 양 혈액 (아가 플레이트)로 보충 TSA 플레이트상에서 세균 성장.
    참고 : 시약을 준비하고 재료 및 장비 표에 요약 된 자료를 조립한다. 각 시약에 대한 최종 농도는 괄호 안에 표시됩니다.
  2. 멸균 면봉을 사용하여 판에서 박테리아를 긁고 구성 요소에서 준비 수정 브루셀라 배지에 접종 (재료 및 장비 표 참조) 콜레스테롤 보충. 37에서 하룻밤 문화를 품다분 수 (rpm)에 200 회전에서 진탕 5 % CO 2로 보충 된 실내 공기를 ° C.
    NOTE : 콜레스테롤 인해 혈청이 복잡하다는 사실에 소 태아 혈청 대신에 사용된다; 이러한 결과에 변화가 발생 헴 (heme) 등의 영양소 철의 다양한 소스를 포함.
  3. 세균 배양의 날, AGS 인간 위 상피 세포를 시드 (ATCC CRL-1739) 12 웰 플레이트 (웰 당 약 1 × 105 세포)의 폴리 D 라이신 처리 된 커버 슬립 상.
  4. 다음 날, 수정 브루셀라 국물 혼자 또는 100 μM 50ml을, 200 μM의 피리 딜 (합성 철 킬레이트), 또는 200 μM의 피리 딜 플러스 250 μM 50ml을 보충 0.3의 OD600에 박테리아 문화를 희석. 200 rpm으로 진탕하면서 5 % CO 2로 보충 된 실내 공기에서 37 ° C에서 4 시간 동안 배양이 부화.
  5. 1,000 XG에 원심 분리기 박테리아는 세포를 수집하고 난을 재 부유하기 전에 상층 액을 제거n은 신선한 수정 된 브루셀라 브로스 동량 콜레스테롤 보충. 문화 (OD600 = 1.0 = 5.5 × 10 8 세포 / ml)의 측정 OD600 감염 20 (MOI)의 다수의 상피 세포에 박테리아를 추가 : 1. 박테리아 세포 생존력을 평가하기 위해 혈액 아가 플레이트 상에 연속 희석 접시 균체를 수행한다.
  6. H.을 품어 주사 전자 현미경 (SEM) 시료 전처리를 수행하기 전에 정적 인 상태에서 5 % CO 2 존재 하 37 ° C에서 4 시간 동안 파이로리 AGS 인간 위 상피 세포 공동 배양.

2. SEM H.을 시각화하는 샘플 준비 pylori의 CAG-T4SS 필리

  1. H. 제거 균 및 인큐베이터와 캔트 배양 상층 액에서 AGS 공동 문화 (IL-8 ELISA에 대한 저장). 0.05 M 나트륨 cacodylate 완충액 (pH 7.4)으로 가볍게 세 번 씻으십시오. , 2.0 % 파라 포름 알데히드 용액에 2.5을 실온에서 2~4시간에 대한 샘플을 수정% 글루 테르 알데히드, 0.05 M 나트륨 cacodylate 버퍼입니다. 차 고정 후, 샘플을 0.05 M 나트륨 cacodylate 버퍼로 3 회 씻는다.
  2. 두 연속 10 분 정착 단계에서 0.05 M 소듐 cacodylate 버퍼에 0.1 % 사 산화 오스뮴을 이용하여 차 고정을 수행한다. 차 고정 후, 샘플을 0.05 M 나트륨 cacodylate 버퍼로 3 회 씻는다.
  3. 기본 및 보조 고정 후, 표 1에 따라 에탄올의 농도가 증가함에 따라 순차적으로 세척하여 샘플을 탈수.
  4. 에탄올 탈수 후 액체 이산화탄소 세 순차 세척을​​ 수행한다. 1073 PSI의 31.1 ºC의 온도 및 압력에서 임계점 건조 기계를 사용 임계점이어서 건조한 샘플.
  5. 마운트는 알루미늄 SEM 샘플 스텁에 된 커버하고 적절한 접지를 달성하고 SEM 이미징 동안 충전을 방지하기 위해 샘플 가장자리에 콜로이드 실버의 얇은 선으로 페인트.
  6. 코트 샘플과는 5nm샘플 2 차 전자 신호 및 에지 효과를 증가시키기 위해 스퍼터 코팅 기계를 사용하여 금 - 팔라듐.

고해상도 현미경 분석 3. 이미징 매개 변수

  1. 이 필드 방출 총 스캐닝 전자 현미경 (FEG-SEM)으로보기 샘플.
  2. 5~10mm의 작동 거리에서 고진공 모드에서 이미지.
  3. 5 kV의에 가속 전압을 설정합니다.
  4. 2-2.5에 자리 크기를 설정합니다.
  5. 호스트 인터페이스 병원체의 더 나은 관점을 달성하기 위해 15 내지 25도 사이의 샘플을 기울인다.
  6. 호스트 병원체 상호 작용의 이들 영역은 필리 - 형성 박테리아 농후 한, 고배율 관찰 용 상피 세포의 가장자리에 부착 된 세균을 이미징 우선 순위.

4. 통계 분석은 필리 정량화를 평가하기

  1. H. 분석 ImageJ에 소프트웨어를 사용하여 파이로리 CAG-T4SS의 필리는 piliated 프 전시 세포의 필리 / 세포의 수뿐만 아니라 퍼센트를 정량화하기아래의 지침에 따라 표현형.
  2. ImageJ에 소프트웨어의 열기 현미경 사진 파일. 균일 한 폭 (10 ~ 13 ㎚)과 길이 (60-150 나노 미터)와 박테리아 세포와 숙주 세포 사이에 형성되는 구조로 필리을 확인합니다.
    NOTE : pilus 구조 주요 ATP 아제 힘 타입 IV 분비 pilus 조립체를 코딩하는 유전자에 불활 항구 이러한 Δ 케이지 변이주로서 동질 균주에 WT 균주에 존재하지만, 존재하지 않는다.
  3. "분석"탭을 클릭 한 다음 직선 도구를 사용하여 선 그리기에 의해 측정 도구를 보정합니다. 드롭 다운 메뉴에서 "설정 규모"를 선택하고 상자 표시 "알려진 거리"로 확대 바 값을 입력하고 적절한 설정 (㎚)로 길이의 단위를 설정합니다. "확인"을 클릭합니다.
  4. pilus의 길이나 폭에 걸쳐 그려 직선 도구를 사용하여 CAG-T4SS의 필리를​​ 측정하고 각 pilus를 측정하기 위해 "Ctrl 키를-M"을 눌러. 측정 값과의 대화 상자를 관찰합니다. 이 값을 기록하거나 복사하여 스프레드 시트 프로그램에 붙여 넣습니다.
  5. 길이를 사용하여 폭 매개 변수는 이전에 CAG-T4SS의 프로필에 맞지 않는 24 무시 기능을 설립했다. 그런 다음 10 ~ 13 nm의 폭 및 60-150 nm의 길이 컷오프 내에있는 값에 기초 필리의 수를 정량화.
  6. 그래프 패드 프리즘 소프트웨어를 사용하여 두 개의 꼬리 학생의 T 시험에 의해 통계적으로 필리의 정량을 분석 할 수 있습니다.

5. 선택 사항 : IL-8 분비의 평가 Pilus 생산과의 상관 관계를 분석하기

  1. 2.1 단계에서 상층 액을 사용하여, 키트 제조 업체의 지침 (재료 및 장비 표 참조) 당 IL-8 ELISA를 수행합니다.
  2. IL-8 숙주 세포에 의해 분비를 분석 단독 배지에서 성장 WT PMSS1에 대해 퍼센트 IL-8 유도를 계산한다. 그래서 그래프 패드 프리즘을 사용하여 두 꼬리 학생의 T 테스트를 사용하여 통계 분석을 수행ftware.

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결과

이 보고서에서 우리는 철의 가용성을 변화의 조건이 H.을 조절하는 능력을 가지고 있음을 증명하고있다 호스트 병원체 인터페이스에서 파이로리 CAG-T4SS의 pilus의 생합성. , H. 단독 배지에서 배양하면 파일로리 3 필리 / 셀의 평균을 형성한다. 때 H. 파일로리 철에서 성장 고갈 세균 성장 (도 1)은 하위 억제이다 (합성 킬레이트 피리 딜 사용) 조건, 박테리아 생성 수많은 CAG-T4SS 필리 (~ 7 필리 / 셀) 때 인간 위암 세포와 공 배양 (그림 2). 영양소 철 외인성 소스가 존재하면 반대로, CAG-T4SS의 필리의 형성이 억제된다 (FE 샘플 1 개 미만 pilus / 셀, 1 미만 pilus / FE +의 DIP 시료 중의 세포) (도 2). 호스트 병원체 인터페이스에서 필리의 정량화 밝혀 그 철 제한, H.의 조건...

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토론

철 박테리아 병원균을 포함한 삶의 대부분의 형태에 필수적인 미량 영양소이다. 미생물 침입의 가능성을 제한하기위한 노력으로, 척추 호스트는 "영양 면역"(18)로 알려진 과정에서 영양소 철을 격리시키는. 이에 응답하여, 박테리아 병원균은 주변 환경을 감지하고 철 수집 시스템, 독소 및 독소 분비 기계 (19, 20)으로 병원성 기능 정교화 조절하는 전역 신호 분자로서 철을 사용하도록 진화했다.

H. 파이로리는 철, 아연, 및 마그네슘 (22)을 성장 및 헴 (heme), 헤모글로빈, 트랜스페린 등의 대체 철 공급원을 사용할 수 있으며, 락토페린 (23) 등의 미량 영양소를 필요로한다. H.을 파이로리는 가장 성공적인 병원균처럼, 호스트 (21)로부터 영양 철을 청소할 수 있도록 독성 요인의 넓은 레퍼토리를 진화했다. 한 독성 인자와...

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공개 사항

저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

감사의 글

이 연구는 Department of Veterans Affairs Career Development Award 1IK2BX001701 및 National Center for Advancing Translational Sciences의 CTSA 상 UL1TR000445의 지원을 받았습니다. 이 문서의 내용은 전적으로 저자의 책임이며 미국 국립중개과학발전센터(National Center for Advancing Translational Sciences) 또는 국립보건원(National Institutes of Health)의 공식 견해를 반드시 나타내는 것은 아닙니다. 주사 전자 현미경 실험은 부분적으로 NIH 보조금 CA68485, DK20593, DK58404, DK59637 및 EY08126의 지원을 받는 VUMC 세포 이미징 공유 리소스를 사용하여 수행되었습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
변형된 브루셀라 육수
펩톤(10g/L)Sigma70172
동물 조직의 펩틱 분해물(10g/L)Sigma70174
효모 추출물(2g/L)Sigma92144
포도당(1g/L)SigmaD9434
염화나트륨(5g/L)Thermo FisherS271-10
콜레스테롤 (250X) (4 ml/L)Life Technologies12531018
염화철(100 또는 250 uM)Sigma157740-100G
디피리딜(200 uM)SigmaD216305-100G
변형 RPMI
RPMI+HEPES (1X)Life Technologies22400-121
소 태아 혈청 ( 100 ml/L)Life Technologies10438-026
전자 현미경 준비
파라포름알데히드(2.0% 수성)전자 현미경 과학15713
글루테알데히드(2.5% 수성)전자 현미경 과학16220
카코딜산나트륨(0.05M)전자 현미경 과학12300
오스뮴 테트록사이드(0.1% 수성)전자 현미경 과학19150
에탄올(절대)시그마E7023
콜로이드 실버 페인트전자 현미경 과학12630
SEM 샘플 스텁전자 현미경 과학75220
커버슬립써모 피셔08-774-383
IL-8 분비 평가
Quantikine IL-8 ELISA kitR& D 시스템D8000C
카제인에서 추출한

참고문헌

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