발달 중에 닭 배아를 보고 접근하는 것은 어려울 수 있습니다. 우리는 간단하고 비용 효율적이며 교실이나 연구 환경에서 쉽게 사용할 수 있는 ex ovo 방법을 개발했습니다. 이 방법은 배아가 배아 발달의 후기 단계로 들어갈 수 있도록 합니다(HH 40).
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이 논문에서
요약
초록
해부학, 발생학, 발생 생물학 분야의 연구는 주로 모델 유기체의 사용에 의존해 왔습니다. 살아있는 배아의 발달을 연구하기 위해 닭과 같은 모델 유기체가 자주 사용됩니다. 닭은 저렴한 비용과 최소한의 유지 관리로 인해 훌륭한 모델 유기체이지만 불투명한 달걀 껍질로 둘러싸여 있기 때문에 관찰에 어려움이 있습니다. 배아가 발달하는 것을 제대로 보려면 껍질에 창문을 열거나 제거해야 합니다. 윈도우잉(windowing)과 난자(ex ovo) 기법은 모두 배아 발달 연구에서 연구자를 돕기 위해 개발되었습니다. 그러나 각 방법에는 한계와 과제가 있습니다. 여기에서는 많은 장기가 발달한 HH 19기부터 발달 후기 단계(HH 40)까지 배아 발달을 관찰할 수 있는 닭 배아에 대한 간단하고 최적화된 난자 배양 기술을 제시합니다. 이 기술은 배아 조작이 수행되는 학부 수업과 고급 연구 실험실 모두에서 쉽게 채택할 수 있습니다.
서론
Ex ovo culturing은 닭의 발달 연구에서 중요한 역할을 해왔다1, 2. 이 배양 방법은 신경 질환, 사지 발달, 두개안면 발달을 연구하고 당뇨병 3, 4, 5와 관련된 기형을 조사하는 모델로 사용되었습니다.
ex ovo 기술에는 많은 변형이 있습니다. 가장 일반적인 방법은 스티로폼 컵6,7,8 또는 유리 그릇5을 사용하는 것입니다. 이러한 방법에서, 컵이나 그릇에 플라스틱 랩을 깔아 배아를 받치고, 컵에 뚜껑을 씌우고, 배아를적절한 습도6의 인큐베이터에 넣습니다. 그러나 이 설정은 기술적으로 어려울 수 있습니다. 첫 번째 문제는 배아를 요람에 넣는 데 사용되는 플라스틱 랩입니다. 이 랩은 작업하기 어렵고 종종 컵에 잘 붙지 않습니다. 이 문제를 해결하기 위해 컵 주위에 고무 밴드를 두어 랩을 제자리에 고정합니다. 그럼에도 불구하고 랩은 여전히 미끄러질 수 있으며, 이는 배아에 치명적입니다. 플라스틱 랩은 배아 조작 및 관찰 중에 사용될 수 있는 집게나 바늘에 의해 찢어지거나 구멍이 날 가능성이 있습니다. 마지막으로, 이 설정은 그다지 안정적이지 않으며 학생들이 컵을 쉽게 넘어뜨릴 수 있습니다. 컵의 높이는 또한 배아를 실체현미경 아래에 배치하는 것을 매우 어렵게 만드는데, 이는 스테이지 높이에 대한 대물렌즈가 제한되어 있습니다. 이러한 문제로 인해 학부생들은 고급 발달 생물학 과정과 같은 교육 실험실에서 살아있는 병아리 배아를 다루기가 어렵습니다.
위의 난소 방법에서의 도전은 연구자들이 배아 병아리 발달을 보기 위해 윈도우 방법 9,10을 사용한다는 것을 의미합니다. 이 기술에서는 배아 위에 있는 난자 껍질에 구멍 또는 "창"을 만듭니다. 구멍은 추가 배아 발달을 허용하기 위해 테이프 또는 왁스9로 다시 밀봉할 수 있습니다. 윈도우 방법은 배아 발달을 볼 수 있는 기능과 유지 보수가 용이한 등 몇 가지 장점이 있지만 이 방법에는 몇 가지 제한 사항도 있습니다. 첫 번째는 전체 배아를 보기 위해(특히 후기 단계에서) 창이 상당히 커야 한다는 것입니다. 둘째, 큰 창문은 밀봉하기 어렵습니다. 부적절한 밀봉은 불임 및 생존 문제를 일으킬 수 있습니다. 용융된 왁스를 실란트로 사용하면 프로토콜에 또 다른 불편하고 지저분한 단계가 추가됩니다. 그러므로, 윈도우 잉(windowing) 방법이 어린 단계(HH 11 – HH 27)의 병아리 배아에 이상적일 수 있지만, 후기 단계에서 전체 배아를 보는 것은 쉽지 않습니다.
여기서, 우리는 첨단 기술의 필요성을 없애고, 실체현미경으로 다루기 쉬우며, 배아가 현미경 조작을 수행할 수 있는 충분한 지지력을 제공하고, 연구자들이 배아의 성장 전체를 발달의 후기 단계(최대 HH 40-41)까지 볼 수 있게 하는 개선되고 간단한 배아 배양 기법11을 설명합니다. 이러한 난자 외 기술의 발전으로 개인은 배아 발달에 대한 보다 완전한 이해에 접근할 수 있습니다. 예를 들어, 후기 단계로 성장하면 개인은 골화, 깃털 발달, 고급 사지 및 눈 발달과 같이 이 시점까지 발생하지 않는 발달 과정을 관찰할 수 있습니다. 전체 배아와 배아 외 막과 혈관 구조가 명확하게 보입니다. 배아 조작(즉, 억제제에 담근 구슬을 이식하거나 조직층 사이에 장벽을 삽입하는 것)과 같은 보다 발전된 연구도 수행할 수 있으며, 연구자들은 후기 단계의 배아에서 조작의 효과를 관찰할 수 있습니다.
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프로토콜
참고 : 모든 소모품은 표 1에 나열되어 있습니다.
1. 닭 배아를 저장
- 약 40 %의 습도 루스가 37 ℃로 수평 루스 균주의 닭 알을 품어 한 번 또는 두 번 매일 계란을 켭니다. 달걀을 돌리면 껍질에 부착 배아를 방지하는 것이 중요하다.
- 4 O C에서 계란을 유지, 이전에, 그렇지 않으면 배아는 노른자 질량에 복부를 위치 할 것이며, 또한 3 단계에서 계란을 여는 손상되는 바와 같이 문화를 설정하여 24 시간에 계란을 설정하지 마십시오 "정지"개발에 배양하기 전에 이하 1 주일도하지만이 적합하지 않습니다.
2. 닭 배아를 준비
- 햄버거와 해밀턴 (12) 스테이징 테이블을 사용하여 닭 배아를 스테이지. 전 비켜 배양를 설정하는 이상적인 단계는 HH 단계 19 ~ 20 (배양 3 약 일) 벡입니다ause이는 머리가 53 HPF에서 전환 직후입니다.
주 : HH 단계 19-20는 다음의 형태 학적 특성을 특징으로한다 : somites 꼬리의 과반수로 연장되어 있지만, 꼬리의 끝은 꼬리 봉오리가 말려, 비분 남아 allantois이 작고 맥관 한계가 다리 싹이 날개 - 싹이보다 큰하고 눈은 착색 또는 회색 빛 색조를 가지고있다.
3. 쉘에서 배아를 제거
- 쉘에서 배아를 제거하기 전에, 70 % 에탄올로 쉘을 스프레이하고 건조 할 수 있습니다. 이 배아를 손상되므로 신속하게 계란을 끄지 마십시오.
- 조심하는 것은 조심스럽게 아래쪽에 계란을 균열, 달걀의 방향을 변경하지 (즉, 배양 중에 복부이었다 측)과 멸균에 배아를 해제 보트 (88 X 88 X 23mm)에 무게. 닦아 70 % 에탄올 보트의 무게. 노른자 자루가 손상되지 않았는지 확인하기 위해 배아를 검사합니다. 노른자 시간의 경우깨진로 생존하지 않으므로, 배아를 폐기합니다.
- 그것이 가능한 지 확인하기 위해 배아를 관찰; 심장 박동, 혈관은 정상 나타나고, 명백한 이상이 존재하지 않습니다. 무게 보트의 가장자리가 건조되었는지 확인합니다.
- 피펫을 사용하여 감염을 방지하기 위해 알부민의 상단에 페니실린 / 스트렙토 마이신의 40 μL (5,000 단위의 페니실린, 1 mL 당 5 mg을 스트렙토 마이신)를 놓습니다.
4. 습도 챔버 준비
- 킴 와이프 - 및 / 또는 멸균 플라스틱 용기 (12 X 12 X 6cm)의 바닥면으로 이루어지는 흡수 패드의 작은 스택을 놓고 70 % 에탄올로 닦았다.
- 김 와이프 및 / 또는면 (물 약 150 ml)에 축축하게 멸균 증류수를 추가합니다.
5. 예 비켜 문화 조립
- 축축한 패딩의 상단에있는 배아를 포함하는 무게 보트를 놓습니다. 그런 다음, t의 상단에 사각형 멸균 페트리 접시 (9.5 X 9.5 cm)의 장소 반그는 느슨한 뚜껑을 형성하기 위해 보트의 무게.
- 그 뚜껑이있는 플라스틱 용기를 커버. 여전히 챔버 내부에 좋은 공기 흐름을 허용하는 부분 도장을 보장, 뚜껑의 두 모서리를 누르십시오.
- 조심스럽게 원하는 단계까지 37 O를 C 배양기에 설치를 놓습니다.
- 제어 습도 배양기를 사용할 수없는 경우, 습도를 제어 할 수 있도록하기 위해 인큐베이터에서 물 용기를 놓습니다. 습도 챔버 및 배양기에서 모든 물을 소독 잠복기 동안 필요에 따라 보충. 40 %의 습도가 이상적입니다.
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결과
방법 비켜이 전 늦게 개발의 단계 (HH 40 ~ 41) (그림 1A 및 1B)에 개발의 초기 단계 (HH 19/20)에서 배아의 관찰이 가능합니다. HH 19 ~ 20에서 문화를 설정하는 것은 문화의 배아의 생존을 증가시킨다. 생존의 문화와 단계 (21) 후 매우 낮은 (53 HPF 전) 선회 머리 이전에, 배아 적은 그대로 배아가 얻어진다 있도록 분리에 쉘에 더 집착하는 경향이있다. (약 40 % HH 40-41로 생존) 일반적으로, 문화 비켜 전에서 배아의 생존은 HH 35 ~ 36 (90~100%)에 높은이지만, 그것은 개발의 고급 단계에 드롭을한다. 그것은 그 발전을 보여왔다 있지만 또한 이러한 후반 단계에서 정상 나타나고 골격의 패터닝 4,15 영향을받지 않습니다, 우리는 사지 골화의 정도 또는 타이밍에 영향을 미칠 수있는 제안이 늦은 단계에서 구부러진 것을 관찰했다. 이다놀라운 일이 아니다 골화에 대한 ...
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토론
배양을 모두 윈도 비켜 예 장점과 도전이있다. 여기에서 우리는 장점과 방법 비켜 스티로폼 컵 전 아래에 표시된 방법 비켜 우리의 최적화 된 예에 윈도우 방법의 문제를 비교합니다. 우리의 방법은 늦게 개발의 단계 및 방법 1, 2 비켜 전통적인 예에 대한 우리의 개선에 조작과 병아리 배아를 관찰 할 수 있도록, 3 학부 교육 실험실 클래스에서 사용하는 것이 또한 매우 간단합니다.
이 수행 할 간단하고 개발의 후반 단계 (HH 41 ~ 42)에 우수한 생존 성을 가지고 있기 때문에 많은 연구자들이 닭 개발을 연구하기 위해 윈도우 방법을 선호하지만, 그것은 한계가있다. 그 중 가장 큰 무대 후 HH (30) HH 단계 (30) 후 전체 배아를 볼 수있는 제한된 능력이다, 달걀 껍질에있는 창은 성장, 이동 배아를 이용하기 위해서는 매...
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공개 사항
저자는이 논문에서 제시된 정보에 관해서 더 경쟁 금융 이익이 없습니다.
감사의 글
우리는 자신의 촬영에서 작업이 원고의 비디오 부분을 편집 마운트 세인트 빈센트 대학의 폴 포이 리어, 미디어 프로듀서, 감사의 말씀을 전합니다. 우리는 자금에 대한 캐나다의 자연 과학 및 공학 연구위원회를 인정합니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 페니실린/스트렙토마이신 | 시그마 | P4458 | 동결/해동 이벤트를 피하기 위해 작은 부분 표본 만들기 |
| 스퀘어 페트리 접시 | 9.5cm x 9.5cm | ||
| 무게 보트 | Fischer Scientific | 8732113 | 88 x 88 x 23mm |
| 지퍼락 컨테이너 | 지퍼락 | N/A | 12cm x 12cm x 6cm |
참고문헌
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