在这里,我们提出了一个协议,允许调查人员通过连接涂上内皮源性黏附分子鼠标循环系统室,以评估白细胞招聘动态体外 。此方法提供了显著优势,因为它允许相对生物学条件下白细胞的评估。
白细胞内皮细胞相互作用的急性和慢性炎症的早期和关键事件,并可以,失调的时候,调解组织损伤导致永久性的病理损害。现有的常规测定法允许白细胞粘附分子的分析只白细胞从血液中提取后。这需要血液经过几个步骤之前外周血白细胞(PBL中)可以准备用于分析,这反过来又可以刺激影响的研究结果的PBL。该微自动注入流动室检测,然而,让科学家用活老鼠的全身流动,同时有操纵涂层室的自由研究早期白细胞功能失调。通过疾病模型,白细胞粘附分子的功能性表达,可以评估和量化在涂覆有固定化的内皮粘连分子体外微玻璃室中。在这个模型中,血液流右颈总动脉和麻醉下活老鼠的左外部颈静脉,允许在腔室天然的PBL的相互作用之间。实时实验分析与活体显微镜的帮助下,以及哈佛仪器加压装置实现的。在该玻璃室中的输入点的流调节器的应用允许可比生理流动条件之间的实验。白细胞滚动速度的主要成果,并采用健康的开放式访问软件ImageJ的全国学院进行测量。综上所述,微自动注入流动室法提供了一个最佳的生理环境研究白细胞内皮细胞的相互作用,并允许研究人员研究炎症时,得出准确的结论。
炎症是机体对损伤的普遍反应,在这两个固有免疫和适应性免疫系统功能的关键一步。响应于损伤和/或炎症刺激,内皮细胞特异性上调粘附分子;这导致通过微血管内皮细胞白细胞外渗,主要是毛细血管后静脉。这个过程开始于自由流动的白细胞在内皮血流的束缚。稳定的轧制和白细胞,这反过来又导致轮回和细胞毒性剂的分泌的牢固粘附,按照此圈养1,2。选择素是已知介导的早期步骤的级联3-5;整合是负责对后面的步骤牢固粘附和轮回1,6-8的。
越来越多的证据表明,人体在缺血再灌注损伤的动物模型白细胞和内皮细胞黏附分子有重要作用,哮喘,银屑病,多发性硬化症,和年龄相关的黄斑变性9-12。在这些条件下,炎症反应是误导攻击自己的身体,导致健康组织的破坏。现有的抗炎剂(如非类固醇抗炎药,皮质类固醇,或其他化学治疗剂)携带的严重副作用长期使用13的风险。因此,它是非常感兴趣的有适当的工具,以确定疾病特异性分子的能力,其可最终定位到具有期望的消炎作用,而剩余的非毒性14。
现有的体外方法如静态白细胞粘附测定法如早在1976年15使用。该平行流动室首次在体外用在1987,研究流动条件下白细胞-内皮相互作用。在这些实验中,刺激呼玛N从静脉血多形核白细胞(PMN)灌注过的原代人脐静脉内皮细胞(HUVECs)的单层。为了控制血液动力学流动条件下,哈佛器械注射泵是采用16。可替代地,为了避免人为白细胞隔离,全血组合使用涂布有固定化的粘附分子17在玻璃室中。
为了避免刺激白细胞和机制上研究近似生理条件下其与粘附分子的相互作用,在体外自动注入,体外循环,动静脉电路开发16。在该电路中,血液中的活老鼠的右颈总动脉和左侧颈外静脉之间流动麻醉下,使玻璃微流腔室涂覆有单个或共同固定化的粘附分子内天然的PBL的相互作用。一个主要的优势,这种SYSTE米是采用基因工程小鼠,其中炎性途径是直接或间接地操纵的能力。此外,还有以查明白细胞粘附分子炎症,游离外部活化的分离的贡献,流动性条件下的能力。一个流量调节器,在流动室的输入点中的应用提供了广泛的剪切力的变化的实验以模拟或者动脉或静脉系统18-22。在这里,我们非常详细地描述关于体外自动注入微流室法的编制和性能的协议。
白细胞募集的方法,是在炎症反应的关键步骤;它涉及到从向靶组织,在那里它们都能够发挥它们的效应子功能的循环系统的白细胞的迁移。白细胞募集是积分在多种炎性病症,如动脉粥样硬化斑块,心肌梗塞,缺血/再灌注,和移植手术1,以及多种与中枢神经系统有关的神经发炎条件10-12,20,24,25。考虑到本病条件白细胞募集跨度的自动注入微腔提供了一个不可或缺的工具,允许研究者研究白细胞迁移动态能力的多样性。
在过去的几十年里,各种体外测定中已开发研究的白细胞粘附26的动态。不幸的是,所有这些测定的要求的提取从血液中的白细胞,引入机械活化。为了更接近体内环境,适应了以收 集全血样本,控制血流动力学流动条件16,17。在这里,我们通过将一涂覆室向小鼠循环系统延伸在该领域中以往的进展。我们能够调节血液的流动的生理范围和研究白细胞滚动的动态。该涂层室让我们来研究具体的粘附分子白细胞相互作用的能力。由于该系统被用作由一个活老鼠操作的单元中,它更紧密地模仿自然的环境中,让我们来研究在多种免疫小鼠模型白细胞 – 内皮相互作用。此外,该系统使我们能够提供的多种基因小鼠模型的优势。而该系统不完全复制的体内环境,它提供了研究specifi一个平台白细胞的生理条件下用C元素,还没有以前是不可能的壮举。虽然这使我们更接近了一步一个更加符合生理环境有限制的制度。它不完全复制的脉管系统的复杂的三维矩阵,所以我们只能够评价被限制在腔室涂层白细胞相互作用的某些要素。此外,大,应注意,以确保封闭系统到鼠标循环由以下中的所有协议中提到的步骤。气泡的引入将大大影响该实验的准确度和可重复性。
尽管我们描述了使用的自动注入微流室的评估白细胞轧制动力学过程必须由调查员进行个性化,研究各种疾病的潜力。例如,癌细胞转移通过表达许多白细胞共享共同整合。学习在克其轧制动力学在一个设置更密切模仿体内环境可能在我们的知识帮助,以及可能的预测的某些癌细胞的侵袭性质,。一种可能的方法可以是一个标记技术结合的癌细胞,如GFP 27,伴随着流室测定法来跟踪表达GFP的肿瘤细胞的轧制动态。定涂覆室与各种物质和连接多个腔室,以相同的鼠标这将是有趣地看到这个过程是如何修改后用于与转基因小鼠和疾病模型组合在其他实验室使用的灵活性。我们在这里描述的技术中仅仅触及一个更广泛的应用潜力,只限于由研究者的创造力。
The authors have nothing to disclose.
R01EY022084 / S1(KMC),T32EY007145(HS)和P30EY014104:研报本出版物中由美国国立卫生研究院国家眼科研究所在奖项数量得到了支持。内容完全是作者的责任,并不一定代表美国国立卫生研究院的官方意见。额外的支持是由马萨诸塞州狮子会眼研究基金(KMC)和特别学者奖从研究到防止失明(以KMC)提供。
Material | Vendor | Part number |
Micro glass chamber 0.4×0.04x50mm | VitroCom | 2540-050 |
Polyethylene tubing PE 10 | Fisher Scientific | 427400 |
Polyethylene tubing PE 60 | Fisher Scientific | 427416 |
Silicone tubing 002 | Fisher Scientific | 11-189-15A |
Y tube | Value Plastics | Y210-6 |
T tube | value plastics | T410-6 |
Silicone gel | Hardware store – Home Depo | |
35mm petri dish | Corning | 430165 |
Parafilm | Pechiney Plastic Packaging | PM996 |
Fine forceps | FST | 11253-25 |
Fine scissors | FST | 15000-08 |
Tube holder | FST | 00608-11 |
Clamp applicator | FST | 18057-14 |
Vascular clamp | FST | 18055-04 |
6-0 silk sutures | George Tiemann & Co | 160-1215-6/0 |
25x1G needles | BD | 305125 |
30×1/2G needles | BD | 305106 |
Heparin 100 USP units/ml | Hospital pharmacy |