Fluorescens Baseret Primer Extension teknik til at bestemme Transkriptionelle udgangspunkter og kløvningsstederne RNaser<em> In Vivo</em

Summary

We here describe a fluorescence based primer extension method to determine transcriptional starting points from bacterial transcripts and RNA processing in vivo using an automated gel sequencer.

Abstract

Fluorescens baserede primerforlængelse (FPE) er en molekylær metode til at bestemme transkriptionelle udgangspunkter eller forarbejdning lokaliteter af RNA-molekyler. Dette opnås ved revers transkription af RNA af interesse under anvendelse af specifikke fluorescensmærkede primere og efterfølgende analyse af de resulterende cDNA-fragmenter ved denaturerende polyacrylamidgelelektroforese. Samtidig er en traditionel Sanger sekventering reaktion kørt på gelen for at kortlægge enderne af cDNA-fragmenterne til deres nøjagtige tilsvarende baser. I modsætning til 5'-RACE (Rapid Amplifikation af cDNA Ends), hvor produktet skal klones og flere kandidater sekventeret, kan hovedparten af ​​cDNA-fragmenter genereret ved primerforlængelse samtidigt detekteres i en gel løb. Derudover kan hele proceduren (fra revers transkription til endelig analyse af resultaterne) udfyldes på én arbejdsdag. Ved hjælp af fluorescens-mærkede primere, brug af farlige radioaktive isotop mærkede reagenserkan undgås, og sagsbehandlingstider er nedbragt så produkterne kan blive fundet under elektroforese procedure.

I den følgende protokol beskriver vi en in vivo fluorescerende primerforlængelse metode til pålideligt og hurtigt påvise 5 'enderne af RNA'er til at udlede transkriptionel udgangspunkter og RNA-forarbejdning sites (fx ved toksin-antitoksin systemkomponenter) i S. aureus, E. coli og andre bakterier.

Introduction

Primerforlængelse ¹ er en molekylær metode til bestemmelse af 5 'enderne af specifikke RNA-molekyler op til én base opløsning. Fordelen ved at andre metoder såsom 5'-RACE (rapid amplifikation af cDNA-ender) er den hurtige behandlingstid og evnen til let at analysere en blanding af forskellige længder af RNA-molekyler.

Denne metode fungerer ved at underkaste RNA-molekyler til at vende transkriptionsreaktioner anvendelse af specifikke fluorescerende primere generere cDNA-fragmenter af visse længder. Disse cDNA-molekyler er sideløbende traditionelle Sanger sekventeringsreaktioner ² på denaturerende polyacrylamidgeler og kan påvises ved deres fluorescens som følge af anvendelsen af fluorescens-mærkede primere. Længderne af de cDNA-fragmenter vurderes derefter ved sammenligning med den sekventeringsstige, tillader kortlægning af 5'-RNA-ender.

Traditionelt er primerforlængelsesreaktioner anvendes i forbindelsemed radioaktive isotoper til påvisning af cDNA-molekyler på X-ray film. Grundet sundhedsfarer, bortskaffelse af affald spørgsmål og lette håndtering, nyere protokoller udnytte fluorescens til påvisning af primerforlængelsen med automatiserede sequencere, omend deres følsomhed er lidt lavere. Brug af fluorescens-mærkede primere, kan den tilbagevendende procedure radio-mærkning undlades, som fluorescerende primere er stabile i lang tid (mere end et år i vores hænder).

Fremgangsmåden beskrevet her anvender en automatiseret gel sequencer, men med små modifikationer kan kapillære sequencers også anvendes til cDNA-separation og detektion ^3. Den parallelle karakter gel analyse gør det muligt at detektere selv en lille mængde RNA spaltning eller forarbejdning. En anden fordel er den høje opløsning af denne fremgangsmåde, som terminal spaltning eller forarbejdning af endnu en base kan detekteres.

Med hensyn til påvisning af RNA-spaltningen eller forarbejdning, typically to forskellige typer af primerforlængelser skelnes. I et tilfælde er den enzymatiske behandling udføres in vitro ved anvendelse af oprenset RNA og oprenset enzym, mens i det andet tilfælde er behandlingen udføres in vivo, og den resulterende RNA renses. I begge tilfælde RNA underkastes et primerforlængelsesprodukt udføres in vitro, dog afhængigt af kilden til RNA, er fremgangsmåden enten kaldes en in vitro eller in vivo primerforlængelse. I protokollen præsenterer vi her fokuserer vi udelukkende på in vivo primerforlængelse grund af brugervenlighed (ingen oprensede proteiner nødvendigt) og muligheden for at bestemme transkriptionelle udgangspunkter og forarbejdning på samme tid. Men i vitro primerforlængelser i princippet oprettet på samme måde og denne protokol kan tjene som udgangspunkt.

Fremgangsmåden er illustreret her, kan anvendes til mange bakteriearter, så længe de er medgørlige til højforberedelse renhed og højt udbytte af nukleinsyrer.

Forskningen i vores laboratorium fokuserer på den regulerende rækkevidde af toksin-antitoksin (TA) systemer ^4,5, et område, hvor primerekstensionsproduktet metode benyttes flittigt. TA-systemer er små genetiske elementer til stede i prokaryote genomer, der består af en stabil og endogent aktivt toksisk protein og en hovedsagelig ustabilt protein eller RNA antitoksin, der modvirker toksicitet ^6,7. Toksin-aktivitet er undertiden udøves ved hæmning af replikation, cellevægsyntese eller andre mekanismer, men oftest af RNase-aktivitet ^8,9. Typisk er RNase specificitet bestemmes ved at udføre forskellige test, hvoraf den ene er primerekstensionsproduktet metode. Primerforlængelsesreaktioner er velegnede til denne anvendelse, som en blanding af spaltede og fuld længde fragmenter samtidig kan analyseres for at bestemme deres 5'-ender. Ved hjælp af en blanding af in vitro og in vivo primerforlængelser, denspecifikke toksin RNase-spaltning, f.eks sekvens specificitet kan bestemmes ^10-13.

Figur 1. Oversigt over primerforlængelse procedure. Bakteriekulturer inkuberes og behandles i henhold til de eksperimentelle behov. Totalt RNA ekstraheres fra cellerne, der er behandlet med DNase I for at fjerne DNA-spor og underkastet en revers transkription under anvendelse af målspecifikke fluorescerende DNA-primere, der giver cDNA. Genomisk DNA eller plasmider ekstraheres og derefter anvendes til fluorescerende Sanger sekventeringsreaktioner for størrelse sammenligning med cDNA-fragmenter. Primerforlængelsesprodukter køres sideløbende Sanger sekventering produkter på en denaturerende polyacrylamidgel urinstof og analyseret med et automatiseret laser og mikroskop. Den sekventering base, der flugter med cDNA bandet er last base af 5'-cDNA-ende (blå pil). Mere information i Fekete, et al. ³ Klik her for at se en større udgave af dette tal.

Et overblik over hele primerforlængelse procedure kan findes i figur 1. Kort fortalt bakterieceller dyrkes, høstes, cellepelleten lyseret, og RNA ekstraheret. Oprenset RNA behandles dernæst med DNase I for at fjerne spor af DNA-molekyler, som kunne fungere som skabeloner for revers transkriptase. Specifikke fluorescerende primere tilsættes til RNA hybridiseret til regionen af ​​interesse og efterfølgende revers transkriberet, resulterer i enkeltstrenget komplementært DNA (cDNA). En sekventeringsstige er skabt af traditionelle Sanger-sekventering anvender fluorescerende primere og separeret på en denaturerende polyacrylamidgel ved siden af ​​primerekstensionsproduktet cDNA-fragmenter. Den resulterendegel analyseres ved at sammenligne de fluorescerende bånd, som muliggør identifikation af 5 'enderne af interesse. Transkriptionelle udgangspunkter og forarbejdning sites derefter vurderes individuelt i sekvens sammenligninger.

Protocol

1. High Yield RNA Forberedelse RNA Isolation BEMÆRK: Høje koncentrationer af total RNA er nødvendige for primerforlængelsesreaktionen. Spin kolonne kits normalt ikke opnåelse af mængden af ​​RNA behov (~ 5-16 ug i 5 pi volumen). Derfor oprensning ved hjælp af syreguanidiniumthiocyanat-phenol-chloroform ekstraktion metode anbefales, skitseret nedenfor. BEMÆRK: Phenol er kræftfremkaldende, giftigt og ætsende. Læs venligst de sikkerhedsdatablade og bruge under en emhætte med passend…

Representative Results

Som vist i figur 6, kan en primerforlængelsesreaktion anvendes til at bestemme de transkriptionelle udgangspunkter transkripter af interesse og kan bidrage til at udlede promotorregioner (typisk identificeres ved -10 og -35 elementer). Den øverste (længste) cDNA fragment repræsenterer 5'-enden af ​​mRNA'et og således let kan kortlægges i forhold til sekventeringsstige. Fig…

Discussion

Fluorescent primerforlængelse er en enkel og hurtig metode til bestemmelse af 5 'enderne af RNA, enten til TSP- eller sekundær RNA-bearbejdning identifikation. På grund af anvendelsen af ​​fluorescerende primere, kan reaktionerne blive oprettet og drives uden yderligere sikkerhedsforanstaltninger (i modsætning til i tilfælde af radioaktivt mærkede primere). Da prøverne påvises ved fluorescens, kan de afbildes mens elektroforese er i gang, som tillader hurtig analyse sammenlignet med radioaktive metoder, …

Materials

Name	Supplier	Catalog Number(s)	Comment
AMV Reverse Transcriptase (20-25 U/µl)	NEB / Roche	NEB: M0277-T / Roche: 10109118001
DNase I (RNase free)	Ambion (life technologies)	AM2222
FastPrep-24 Instrument	MPBio	116004500
Fluorescently labeled primers	Biomers	n/a	5’ DY-681 modification of “ordinary” DNA oligonucleotides. Compatible dyes such as the LICOR IRDye 700/800 are also available from other suppliers such as IDTdna.
Li-Cor 4200 Sequencer incl. ImagIR Data collection software	Li-Cor		Product discontinued
NanoDrop 2000	Thermo Scientific
Nuclease free water	Ambion (life technologies)	AM9915G
Plasmid mini preparation kit	QIAGEN	12125
RapidGel-XL-40% Concentrate	USB	US75863
RNA STORAGE BUFFER	Ambion (life technologies)	AM7000
Roti-Aqua-P/C/I	Carl Roth	X985.3	Alternative: “Acid-Phenol:Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1)” from Ambion (AM9720)
SUPERase•In RNase Inhibitor	Ambion (life technologies)	AM2696
Thermo Sequenase fluorescently labelled primer cycle sequencing kit with 7-deaza-dGTP	GE Healthcare	RPN2538
TRIzol reagent	life technologies	15596-026
Zirconia/Silica Beads 0.1 mm	BioSpec	11079101z