Fluorescentie gebaseerde primer Extension Techniek om Transcriptioneel uitgangspunten en Splitsing Sites van RNases Bepaal<em> In Vivo</em
Summary
We here describe a fluorescence based primer extension method to determine transcriptional starting points from bacterial transcripts and RNA processing in vivo using an automated gel sequencer.
Abstract
Fluorescentie gebaseerde primer extensie (FPE) is een moleculaire methode om transcriptionele startpunten of verwerking websites van RNA-moleculen te bepalen. Dit wordt bereikt door reverse transcriptie van het RNA van belang met specifieke fluorescent gelabelde primers en daaropvolgende analyse van de resulterende cDNA-fragmenten door denaturerende polyacrylamidegelelektroforese. Tegelijkertijd wordt een traditionele Sanger sequencing reactie uitgevoerd op de gel aan de uiteinden van de cDNA-fragmenten wijzen aan hun exacte overeenkomstige basen. In tegenstelling tot de 5'-RACE (Rapid Amplification van cDNA Ends), waarbij het product moet worden gekloneerd en meerdere kandidaat sequentie, kan het grootste deel van de cDNA-fragmenten gegenereerd door primerverlenging gelijktijdig worden gedetecteerd in een gel run. Bovendien kan de gehele procedure (van reverse transcriptie tot de uiteindelijke analyse van de resultaten) in een werkdag worden ingevuld. Door fluorescerend gemerkte primers, het gebruik van gevaarlijke radioactieve isotoop gemerkte reagentiakan worden vermeden en doorlooptijden worden gereduceerd producten tijdens de elektroforese procedure kan worden gedetecteerd.
In het volgende protocol beschrijven we een in vivo fluorescentie primerverlenging methode uiteinden van de RNA 5 'betrouwbaar en snel detecteren afleiden transcriptionele startpunten en RNA verwerking gebeurt (bijvoorbeeld door toxine-antitoxine systeemcomponenten) in S. aureus, E. coli en andere bacteriën.
Introduction
Primerverlenging 1 is een moleculaire methode uiteinden van specifieke RNA-moleculen van de 5 'bepalen tot een basisresolutie. Het voordeel van andere methoden, zoals 5'-RACE (snelle amplificatie van cDNA uiteinden) is de snelle doorlooptijd en de mogelijkheid om een mengsel van verschillende lengtes van RNA-moleculen gemakkelijk analyseren.
Deze methode werkt door het onderwerpen RNA moleculen transcriptiereacties keren met specifieke fluorescente primers genereren cDNA fragmenten van bepaalde lengte. Deze cDNA-moleculen worden uitgevoerd naast de traditionele Sanger sequencing reacties 2 op denaturerende polyacrylamide gelen en kan worden gedetecteerd door de fluorescentie door het gebruik van fluorescent gemerkte primers. De lengte van de cDNA-fragmenten worden vervolgens beoordeeld in vergelijking met de sequentie ladder, waardoor het in kaart brengen van het 5'-RNA uiteinden.
Traditioneel worden primerverlengingsreacties in combinatiemet radioactieve isotopen cDNA moleculen op röntgenfilms detecteren. Door gezondheid, kwesties afvalverwerking en gebruiksgemak, nieuwere protocollen gebruiken fluorescentie voor de detectie van de primerverlenging met automatische sequencers, hoewel de gevoeligheid iets lager. Met fluorescent gelabelde primers, kan de terugkerende radioactieve labeling procedure worden weggelaten, als fluorescerende primers zijn stabiel gedurende lange tijd (meer dan een jaar in onze handen).
De hier beschreven werkwijze maakt gebruik van een geautomatiseerde sequencer gel, maar met lichte wijzigingen kunnen capillaire sequencer ook worden gebruikt voor de cDNA scheiding en detectie 3. Het parallellisme gel analyse maakt het mogelijk om zelfs een kleine hoeveelheid RNA splitsing of verwerking detecteren. Een ander voordeel is de hoge resolutie van deze werkwijze, als eindstandige splitsing en verwerking van zelfs één base kan worden gedetecteerd.
Met betrekking tot de detectie van RNA splitsing of verwerkingen typically twee verschillende primer extensions onderscheiden. In één geval wordt de enzymatische behandeling uitgevoerd in vitro met gezuiverde RNA en gezuiverd enzym, terwijl in het andere geval wordt de verwerkingen in vivo en de resulterende RNA wordt gezuiverd. In beide gevallen het RNA onderworpen aan een primer extensie in vitro uitgevoerd, echter afhankelijk van de bron van RNA, wordt de werkwijze ofwel genoemd in vitro of in vivo primer extensie. In het protocol hier geïntroduceerde richten we alleen op in vivo primerverlenging, vanwege het gebruiksgemak (niet gezuiverde eiwitten nodig) en de mogelijkheid om transcriptionele startpunten en verwerking uit te tegelijkertijd. In vitro primerverlengingen in principe ingesteld op dezelfde manier en dit protocol kan dienen als uitgangspunt.
De werkwijze hier afgebeelde kan worden toegepast op vele bacteriesoorten zolang ze vatbaar hoogzuiverheid en hoge opbrengst bereiden van nucleïnezuren.
Het onderzoek in ons lab richt zich op het regelgevend kader van toxine-antitoxine (TA) systemen van 4,5, een terrein waarop de primer extension method grote schaal wordt gebruikt. TA-systemen zijn kleine genetische elementen in prokaryotische genomen dat bestaat uit een stabiele en endogeen actief toxische eiwit en een meestal onstabiel eiwit of RNA antitoxine die toxiciteit 6,7 tegengaat. Toxine activiteit wordt soms uitgeoefend door remming van de replicatie, celwand synthese of andere mechanismen, maar meestal door RNase activiteit 8,9. Typisch wordt RNase specificiteit bepaald door het uitvoeren van verschillende tests, waaronder de primer extensie methode. Primerverlengingsreacties zijn geschikt voor deze toepassing, als een mengsel van volledige lengte gesplitst en fragmenten tegelijkertijd worden geanalyseerd om te bepalen hun 5 'einden. Een mix van in vitro en in vivo primer extensions, despecifieke toxine RNase splitsing, bijvoorbeeld sequentie specificiteit te bepalen 10-13.
Figuur 1. Overzicht van primerverlenging procedure. Bacteriële kweken worden geïncubeerd en behandeld volgens de experimentele behoeften. Totaal RNA wordt geëxtraheerd uit de cellen, behandeld met DNase I bij DNA sporen te verwijderen en onderworpen aan een reverse transcriptie reactie met doelspecifieke fluorescente DNA primers hetgeen cDNA. Genomisch DNA of plasmiden worden geëxtraheerd en vervolgens gebruikt voor fluorescerende Sanger sequentiebepaling reacties voor maat vergeleken met de cDNA-fragmenten. Primerverlengingsproducten worden omzomen Sanger sequentiebepaling producten op een denaturerende ureum polyacrylamidegel en geanalyseerd met een geautomatiseerde laser en microscoop. De sequencing basis die lijn staat met de cDNA band is de last basis van de 5 'cDNA (blauwe pijl). Meer informatie in Fekete, et al. 3 Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Een overzicht van de gehele primerverlenging procedure is te vinden in figuur 1. In het kort, bacteriële cellen worden gekweekt, geoogst, de cel pellet gelyseerd en het RNA geëxtraheerd. Gezuiverd RNA wordt vervolgens behandeld met DNase I om sporen van DNA moleculen die kunnen fungeren als sjablonen voor de reverse transcriptase verwijderen. Specifieke fluorescerende primers worden toegevoegd aan het RNA gehybridiseerd aan het gebied van belang en vervolgens reverse getranscribeerd, waardoor enkelstrengs complementair DNA (cDNA). Een sequentie ladder wordt gemaakt door traditionele Sanger sequentiebepaling gebruik fluorescente primers en gescheiden op een denaturerende polyacrylamide gel naast het primerverlengingsproduct cDNA fragmenten. Het resulterendegel geanalyseerd door vergelijking van de fluorescerende banden, waardoor de identificatie van uiteinden van belang de 5 '. Transcriptionele uitgangspunten en verwerking sites worden vervolgens individueel door sequentievergelijkingen beoordeeld.
Protocol
Representative Results
Discussion
Fluorescerende primer extensie is een eenvoudige en snelle werkwijze voor het bepalen uiteinden van de RNA 5 ', zowel voor TSP- of secundaire RNA processing identificatie. Door het gebruik van fluorescente primers, kan de reactie worden opgezet en uitgevoerd zonder extra veiligheidsmaatregelen (anders dan bij radioactief gemerkte primers). De monsters worden gedetecteerd door fluorescentie, kunnen ze worden afgebeeld terwijl de elektroforese wordt uitgevoerd die een snelle analyse mogelijk maakt in vergelijking met …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Anne Wochele for her assistance in the laboratory and Vera Augsburger for help with the automated gel sequencer. We thank the Deutsche Forschungsgemeinschaft for funding by grants BE4038/2 and BE4038/5 within the “priority programmes” SPP1316 and SPP1617.
Materials
| Name | Supplier | Catalog Number(s) | Comment |
| AMV Reverse Transcriptase (20-25 U/µl) | NEB / Roche | NEB: M0277-T / Roche: 10109118001 | |
| DNase I (RNase free) | Ambion (life technologies) | AM2222 | |
| FastPrep-24 Instrument | MPBio | 116004500 | |
| Fluorescently labeled primers | Biomers | n/a | 5’ DY-681 modification of “ordinary” DNA oligonucleotides. Compatible dyes such as the LICOR IRDye 700/800 are also available from other suppliers such as IDTdna. |
| Li-Cor 4200 Sequencer incl. ImagIR Data collection software | Li-Cor | Product discontinued | |
| NanoDrop 2000 | Thermo Scientific | ||
| Nuclease free water | Ambion (life technologies) | AM9915G | |
| Plasmid mini preparation kit | QIAGEN | 12125 | |
| RapidGel-XL-40% Concentrate | USB | US75863 | |
| RNA STORAGE BUFFER | Ambion (life technologies) | AM7000 | |
| Roti-Aqua-P/C/I | Carl Roth | X985.3 | Alternative: “Acid-Phenol:Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1)” from Ambion (AM9720) |
| SUPERase•In RNase Inhibitor | Ambion (life technologies) | AM2696 | |
| Thermo Sequenase fluorescently labelled primer cycle sequencing kit with 7-deaza-dGTP | GE Healthcare | RPN2538 | |
| TRIzol reagent | life technologies | 15596-026 | |
| Zirconia/Silica Beads 0.1 mm | BioSpec | 11079101z |
References
- Simpson, C. G., Brown, J. W. Primer extension assay. Methods Mol. Biol. 49, 249-256 (1995).
- Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 74, 5463-5467 (1977).
- Fekete, R. A., Miller, M. J., Chattoraj, D. K. Fluorescently labeled oligonucleotide extension: a rapid and quantitative protocol for primer extension. Biotechniques. 35, 90-94 (2003).
- Schuster, C. F., et al. Characterization of a mazEF Toxin-Antitoxin Homologue from Staphylococcus equorum. J. Bacteriol. 195, 115-125 (2013).
- Nolle, N., Schuster, C. F., Bertram, R. Two paralogous yefM-yoeB loci from Staphylococcus equorum encode functional toxin-antitoxin systems. Microbiology. 159, 1575-1585 (2013).
- Yamaguchi, Y., Park, J. H., Inouye, M. Toxin-antitoxin systems in bacteria and archaea. Annu. Rev. Genet. 45, 61-79 (2011).
- Schuster, C. F., Bertram, R. Toxin-antitoxin systems are ubiquitous and versatile modulators of prokaryotic cell fate. FEMS Microbiol. Lett. 340, 73-85 (2013).
- Goeders, N., Van Melderen, L. Toxin-antitoxin systems as multilevel interaction systems. Toxins. 6, 304-324 (2014).
- Yamaguchi, Y., Inouye, M. mRNA interferases, sequence-specific endoribonucleases from the toxin-antitoxin systems. Progress in molecular biology and translational science. 85, 467-500 (2009).
- Park, J. H., Yamaguchi, Y., Inouye, M. Bacillus subtilis MazF-bs (EndoA) is a UACAU-specific mRNA interferase. FEBS Lett. 585, 2526-2532 (2011).
- Zhu, L., et al. et al.Staphylococcus aureus MazF specifically cleaves a pentad sequence, UACAU, which is unusually abundant in the mRNA for pathogenic adhesive factor SraP. J. Bacteriol. 191, 3248-3255 (2009).
- Zhu, L., et al. The mRNA interferases, MazF-mt3 and MazF-mt7 from Mycobacterium tuberculosis target unique pentad sequences in single-stranded RNA. Mol. Microbiol. 69, 559-569 (2008).
- Fu, Z., Donegan, N. P., Memmi, G., Cheung, A. L. Characterization of MazFSa, an endoribonuclease from Staphylococcus aureus. J. Bacteriol. 189, 8871-8879 (2007).
- Marmur, J. A procedure for the isolation of deoxyribonucleic acid from micro-organisms. J. Mol. Biol. 3, 208-218 (1961).
- Emory, S. A., Belasco, J. G. The ompA 5′ untranslated RNA segment functions in Escherichia coli as a growth-rate-regulated mRNA stabilizer whose activity is unrelated to translational efficiency. J. Bacteriol. 172, 4472-4481 (1990).
- Cole, S. T., Bremer, E., Hindennach, I., Henning, U. Characterisation of the promoters for the ompA gene which encodes a major outer membrane protein of Escherichia coli. Mol. Gen. Genet. 188, 472-479 (1982).
- Schleifer, K. H., Kilpper-Bälz, R., Devriese, L. Staphylococcus arlettae sp. nov., S. equorum sp. nov. and S. kloosii sp. nov.: Three New Coagulase-Negative, Novobiocin-Resistant Species from Animals. Syst. Appl. Microbiol. 5, 501-509 .
- Yu, H., Goodman, M. F. Comparison of HIV-1 and avian myeloblastosis virus reverse transcriptase fidelity on RNA and DNA templates. J. Biol. Chem. 267, 10888-10896 (1992).
- Ying, B. W., Fourmy, D., Yoshizawa, S. Substitution of the use of radioactivity by fluorescence for biochemical studies of RNA. RNA. 13, 2042-2050 (2007).
