Fluorescence Basé Technique d'extension d'amorce pour déterminer transcription Points de départ et des sites de clivage de RNases<em> In Vivo</em

Summary

We here describe a fluorescence based primer extension method to determine transcriptional starting points from bacterial transcripts and RNA processing in vivo using an automated gel sequencer.

Abstract

L'extension d'amorce à base de fluorescence (FPE) est une méthode moléculaire pour déterminer les points de départ de la transcription ou des sites de traitement de molécules d'ARN. Ce résultat est obtenu par transcription inverse de l'ARN d'intérêt en utilisant des amorces marquées par fluorescence spécifiques et l'analyse ultérieure des fragments d'ADNc obtenus par électrophorèse dénaturante sur gel de polyacrylamide. En même temps, une réaction classique de séquençage de Sanger est exécuté sur le gel vers la carte les extrémités des fragments d'ADNc à leurs bases correspondantes exactes. Contrairement à 5'-RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends), où le produit doit être cloné et séquencé plusieurs candidats, la majeure partie des fragments d'ADNc générés par extension d'amorce peut être détecté simultanément en une seule opération de gel. En outre, l'ensemble de la procédure (à partir de la transcription inverse de l'analyse finale des résultats) peut être complété en une journée de travail. En utilisant des amorces marquées par fluorescence, l'utilisation de réactifs dangereux isotope radioactif étiquetépeut être évitée et les délais de traitement sont réduites comme produits peuvent être détectés au cours de la procédure d'électrophorèse.

Dans le protocole suivant, nous décrivons une méthode d'extension d'amorce fluorescente in vivo pour détecter de manière fiable et rapide des extrémités 5 'des ARN de déduire la transcription des points de départ et les sites de traitement de l'ARN (par exemple, par les composants du système toxine-antitoxine) en S. aureus, E. coli et d'autres bactéries.

Introduction

^Une extension d'amorce est une méthode moléculaire pour déterminer les extrémités 5 'des molécules d'ARN spécifiques à une résolution d'une base. L'avantage à d'autres méthodes telles que 5'-RACE (amplification rapide des extrémités d'ADNc) est le délai d'exécution rapide et la capacité d'analyser facilement un mélange de différentes longueurs de molécules d'ARN.

Cette méthode fonctionne en soumettant des molécules d'ARN à des réactions de transcription inverse en utilisant des amorces fluorescentes spécifiques, générant des fragments d'ADNc de certaines longueurs. Ces molécules d'ADNc sont longent les réactions de séquençage de Sanger traditionnels ² sur des gels dénaturants de polyacrylamide et peuvent être détectés par leur fluorescence en raison de l'utilisation d'amorces marquées par fluorescence. Les longueurs des fragments d'ADNc sont ensuite évaluées par comparaison de l'échelle de séquençage, ce qui permet la mise en correspondance de l'extrémité 5 'de l'ARN.

Traditionnellement, les réactions d'extension d'amorces sont utilisées en conjonctionavec des isotopes radioactifs pour détecter des molécules d'ADNc sur des films radiographiques. En raison de risques pour la santé, les problèmes d'élimination des déchets et la facilité de manipulation, des protocoles plus récents utilisent la fluorescence pour la détection de l'extension d'amorce avec des séquenceurs automatiques, mais leur sensibilité est légèrement inférieure. En utilisant des amorces marquées par fluorescence, la procédure récurrente de radio-étiquetage peut être omis, comme des amorces fluorescentes sont stables pendant une longue période (plus d'un an dans nos mains).

La méthode que nous décrivons ici utilise un séquenceur automatisé de gel, mais avec de légères modifications, séquenceurs capillaires peut être également utilisée pour la séparation et la détection de l'ADNc ^3. La nature de l'analyse parallèle de gel permet de détecter même une petite quantité de clivage de l'ARN ou de traitement. Un autre avantage est la haute résolution de cette méthode, comme clivage ou le traitement d'une seule base de la borne peut être détecté.

En ce qui concerne la détection de clivage d'ARN ou de transformation, tabituellement deux différents types d'extensions d'amorces sont distingués. Dans un cas, le traitement enzymatique est effectué in vitro en utilisant l'ARN purifié et enzyme purifiée, alors que dans l'autre cas, le traitement est réalisé in vivo et l'ARN obtenu est purifié. Dans les deux cas, l'ARN est soumis à une extension d'amorce effectuée in vitro, cependant, en fonction de la source d'ARN, le procédé est appelé soit une extension d'amorce in vitro ou in vivo. Dans le protocole que nous présentons ici, nous nous concentrons uniquement sur ​​l'extension vivo en primaire, en raison de la facilité d'utilisation (pas de protéines purifiées nécessaire) et la possibilité de déterminer les points de départ de la transcription et de traitement dans le même temps. Cependant, in vitro extensions d'amorces sont en principe mis en place de la même manière et ce protocole peuvent servir de point de départ.

Le procédé illustré ici peut être appliquée à de nombreuses espèces bactériennes tant qu'ils se prêtent à une grandepureté et à haut rendement de préparation d'acides nucléiques.

La recherche dans notre laboratoire se concentre sur la portée réglementaire de la toxine-antitoxine (TA-systèmes) ^4,5, un domaine dans lequel la méthode d'extension d'amorce est largement utilisé. AT-systèmes sont de petits éléments génétiques présents dans les génomes procaryotes qui sont constitués d'une protéine toxique et stable et actif de manière endogène une protéine ou un ARN essentiellement instable antitoxine qui neutralise la toxicité ^6,7. l'activité de la toxine est parfois exercée par inhibition de la réplication, la synthèse de la paroi cellulaire ou d'autres mécanismes, mais le plus souvent par l'activité RNase ^8,9. En général, la spécificité de la RNase est déterminée en effectuant des tests différents, dont l'un est le procédé d'extension d'amorce. Réactions d'extension d'amorce sont bien adaptés pour cette application, comme un mélange de fragments de longueur clivés et complètes peuvent être analysés simultanément pour déterminer leurs extrémités 5 '. Utilisation d'un mélange de in vitro et in vivo des extensions d'amorce, latoxine spécifique clivage RNase, par exemple, une spécificité de séquence peut être déterminée ^{10 à 13.}

Figure 1. Vue d'ensemble de la procédure d'extension d'amorce. Les cultures bactériennes sont incubées et traitées selon les besoins expérimentaux. L'ARN total est extrait des cellules, traités à la DNase I pour éliminer les traces d'ADN et soumis à une réaction de transcription inverse en utilisant des amorces fluorescentes spécifiques des cibles d'ADN donnant des ADNc. L'ADN génomique ou de plasmides sont extraites et utilisées par la suite pour des réactions de séquençage de Sanger fluorescentes pour la comparaison de la taille des fragments d'ADNc. Produits d'extension d'amorce sont longent produits de séquençage Sanger sur un gel de polyacrylamide dénaturant urée et analysés avec un laser automatisé et microscope. La base de séquençage qui aligne avec la bande d'ADNc est laer but de l'extrémité 5 'de l'ADNc (flèche bleue). Plus d'informations dans Fekete, et al. ³ Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Une vue d'ensemble de l'ensemble de la procédure d'extension d'amorce se trouve dans la figure 1. En bref, les cellules bactériennes sont cultivées, récoltées, le culot de cellules lysées et l'ARN extrait. L'ARN purifié est ensuite traité avec de la DNase I pour éliminer les traces de molécules d'ADN qui pourraient agir en tant que modèles pour la transcriptase inverse. Des amorces fluorescentes spécifiques sont ajoutés à l'ARN, hybride à la région d'intérêt et inverser ensuite transcrit, résultant en un ADN complémentaire simple brin (ADNc). Une échelle de séquençage est réalisé par séquençage de Sanger traditionnel utilisant des amorces fluorescentes et séparé sur un gel de polyacrylamide dénaturant à côté de l'extension des fragments d'ADNc d'amorces. La résultantegel est analysé par comparaison des bandes fluorescentes, permettant l'identification des extrémités 5 'd'intérêt. Points de départ de la transcription et des sites de traitement sont ensuite évaluées individuellement par des comparaisons de séquences.

Protocol

1. ARN à haut rendement Préparation Isolement de l'ARN REMARQUE: Les fortes concentrations d'ARN total sont nécessaires pour la réaction d'extension d'amorce. Kits de colonne de centrifugation ne donnent généralement pas la quantité d'ARN nécessaire (~ 5 à 16 ug dans un volume de 5 ul). Par conséquent, la purification en utilisant la méthode d'extraction thiocyanate-phénol-chloroforme guanidinium acide est recommandé, décrit ci-dessous. REMARQUE: Le phénol …

Representative Results

Comme le montre la figure 6, une réaction d'extension d'amorce peut être utilisée pour déterminer les points de départ de la transcription de transcrits d'intérêt et peut aider à déduire régions promotrices (typiquement identifié par -10 et -35 éléments). La plus haute (la plus longue) représente un fragment d'ADNc de l'extrémité 5 de l'ARNm et peut donc être facilement mis en correspondance par rapport à l'échelle de séquençage. <p class="jove_conten…

Discussion

Extension d'amorce fluorescente est une méthode simple et rapide pour déterminer les extrémités 5 'des ARN, soit pour TSP ou l'identification de la transformation secondaire de l'ARN. Grâce à l'utilisation d'amorces fluorescentes, les réactions peuvent être mises en place et fonctionnent sans précautions de sécurité supplémentaires (contrairement au cas des amorces marquées de manière radioactive). Étant donné que les échantillons sont détectés par fluorescence, ils peuvent êt…

Materials

Name	Supplier	Catalog Number(s)	Comment
AMV Reverse Transcriptase (20-25 U/µl)	NEB / Roche	NEB: M0277-T / Roche: 10109118001
DNase I (RNase free)	Ambion (life technologies)	AM2222
FastPrep-24 Instrument	MPBio	116004500
Fluorescently labeled primers	Biomers	n/a	5’ DY-681 modification of “ordinary” DNA oligonucleotides. Compatible dyes such as the LICOR IRDye 700/800 are also available from other suppliers such as IDTdna.
Li-Cor 4200 Sequencer incl. ImagIR Data collection software	Li-Cor		Product discontinued
NanoDrop 2000	Thermo Scientific
Nuclease free water	Ambion (life technologies)	AM9915G
Plasmid mini preparation kit	QIAGEN	12125
RapidGel-XL-40% Concentrate	USB	US75863
RNA STORAGE BUFFER	Ambion (life technologies)	AM7000
Roti-Aqua-P/C/I	Carl Roth	X985.3	Alternative: “Acid-Phenol:Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1)” from Ambion (AM9720)
SUPERase•In RNase Inhibitor	Ambion (life technologies)	AM2696
Thermo Sequenase fluorescently labelled primer cycle sequencing kit with 7-deaza-dGTP	GE Healthcare	RPN2538
TRIzol reagent	life technologies	15596-026
Zirconia/Silica Beads 0.1 mm	BioSpec	11079101z