Fluorescens Basert Primer Extension Technique fastslår Transkripsjon utgangspunkt og Cleavage Nettsteder av RNases<em> In Vivo</em

Summary

We here describe a fluorescence based primer extension method to determine transcriptional starting points from bacterial transcripts and RNA processing in vivo using an automated gel sequencer.

Abstract

Fluorescens basert primer extension (FPE) er en molekylær metode for å bestemme transkripsjonsutgangspunkter eller områder for behandling av RNA-molekyler. Dette er oppnådd ved revers transkripsjon av RNA av interesse med bestemte fluorescensmerkede primere og etterfølgende analyse av de resulterende cDNA-fragmenter ved denaturerende polyakrylamidgelelektroforese. Samtidig blir en tradisjonell Sanger-sekvenseringsreaksjon kjørt på gelen for å kartlegge endene av cDNA-fragmenter i deres eksakte tilsvarende baser. I motsetning til 5'-RACE (Rapid Forsterkning av cDNA Ends), der produktet skal være klonet og flere kandidater sekvensert, kan mesteparten av cDNA fragmenter generert av primer extension samtidig bli oppdaget i en gel løp. I tillegg kan hele prosedyren (fra revers transkripsjon til endelig analyse av resultatene) være ferdig i en arbeidsdag. Ved hjelp av fluorescensmerkede primere, bruk av farlige radioaktiv isotop merket reagenserkan unngås, og behandlingstiden er redusert som produkter kan oppdages under elektroforese prosedyren.

I det følgende protokoll, beskriver vi en in vivo fluorescerende primer extension metode for å pålitelig og raskt oppdage 5 'endene av RNA å utlede transkripsjonen utgangspunkt og RNA prosessering områder (for eksempel ved gift antitoksin systemkomponenter) i S. aureus, E. coli og andre bakterier.

Introduction

Primerforlengelse ¹ er en molekyl metode for å bestemme den 5 'ende av spesifikke RNA-molekyler opp til en basisoppløsning. Fordelen med andre metoder som for eksempel 5'-RACE (rask amplifikasjon av cDNA-ender) er den raske behandlingstid og muligheten til enkelt å analysere en blanding av forskjellige lengder av RNA-molekyler.

Denne metoden fungerer ved å utsette RNA-molekyler til å reversere transkripsjons reaksjoner ved bruk av spesifikke fluorescerende primere, genererer cDNA fragmenter av visse lengder. Disse cDNA-molekyler som blir drevet ved siden av tradisjonelle Sanger-sekvenseringsreaksjoner ² på denaturerende polyakrylamidgeler og kan påvises ved deres fluorescens på grunn av bruk av fluorescensmerkede primere. Lengdene av cDNA-fragmentene blir så vurdert ved sammenligning av sekvenserings-stige, slik at tilordningen av de 5 'ender RNA.

Tradisjonelt blir primerekstensjonsreaksjoner brukes i forbindelsemed radioaktive isotoper til å oppdage cDNA molekyler på X-ray filmer. På grunn av helsefare, avfallshåndtering problemer og enkel håndtering, nyere protokoller utnytte fluorescens for påvisning av primer extension med automatiserte sequencere, om enn deres følsomhet er noe lavere. Ved hjelp av fluorescensmerkede primere kan gjentakende radiomerking prosedyre utelates, som fluorescerende primere er stabile over lang tid (mer enn et år i våre hender).

Metoden vi beskriver her benytter en automatisert gel sequencer, men med litt modifikasjoner, kan kapillær sequencere også brukes for cDNA separasjon og deteksjon ^tre. Den parallelle arten av gel-analyse gjør det mulig å påvise selv en liten mengde av RNA-spaltning eller foredling. En annen fordel er den høye oppløsning av denne fremgangsmåten, som terminal spaltning eller foredling av enda en base kan detekteres.

Med hensyn til påvisning av RNA-spaltning eller foredling, typically to forskjellige typer primer utvidelser skilles. I ett tilfelle blir den enzymatiske behandling utføres in vitro ved anvendelse av renset RNA og renset enzym, mens i det andre tilfellet blir behandlingen utført in vivo, og det resulterende RNA blir renset. I begge tilfeller RNA underkastes en primer-forlengelse utføres in vitro, men avhengig av kilden av RNA, er fremgangsmåten kalles en enten in vitro eller in vivo primer-forlengelse. I protokollen vi presenterer her, har vi fokus utelukkende på in vivo primerforlengelse, på grunn av enkel bruk (ingen rensede proteiner nødvendig) og muligheten for å bestemme transkripsjonelle startpunkter og behandling på samme tid. Imidlertid in vitro primer utvidelser er i prinsippet satt opp på samme måte, og denne protokollen kan tjene som et utgangspunkt.

Metoden som er illustrert her, kan anvendes på mange bakteriearter, så lenge de er mottagelig for høyrenhet og high-yield utarbeidelse av nukleinsyrer.

Forskningen i vår lab fokuserer på den regulatoriske omfanget av toksin-antitoxin (TA) systemer ^4,5, et felt der primer extension-metoden er mye brukt. TA-systemer er små genetiske elementer som finnes i prokaryote genomer som består av et stabilt og aktivt endogent toksisk protein og en for det meste ustabil protein eller RNA-antitoxin som motvirker giftighet ^6,7. Toxin-aktivitet er noen ganger som utøves av inhibering av replikasjon, celleveggsyntese eller andre mekanismer, men oftest ved RNase-aktivitet ^8,9. Vanligvis er RNase spesifisitet bestemmes ved å utføre forskjellige tester, hvorav den ene er den primereksten metoden. Primerekstensjonsreaksjoner er vel egnet for denne anvendelse, som en blanding av full lengde og spaltede fragmenter kan samtidig analysert for å bestemme deres 5 'ender. Ved hjelp av en blanding av in vitro og in vivo primer utvidelser, denbestemt toksin RNase cleavage, f.eks sekvens spesifisitet kan bestemmes ^10-13.

Figur 1. Oversikt over primer-forlengelsesprosedyren. Bakterielle kulturer ble inkubert og behandlet i henhold til de eksperimentelle behov. Total RNA ekstraheres fra cellene, som ble behandlet med DNase for å fjerne DNA-spor og underkastet en reverstranskripsjonsreaksjon under anvendelse av mål-spesifikke primere ettergivende fluorescerende DNA-cDNA. Genomisk DNA eller plasmider er trukket ut og senere brukes til fluorescerende Sanger-sekvenseringsreaksjoner for sammenligning størrelse med cDNA fragmenter. Primer-ekstensjonsprodukter er kjørt sammen med Sanger-sekvenseringsprodukter på en denaturerende urea-polyakrylamidgel og analysert med en automatisert laser og mikroskop. Sekvenser base som kommer på linje med cDNA båndet er last base av 5'-ende-cDNA (blå pil). Mer informasjon i Fekete, et al. ³ Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

En oversikt over hele primereksten prosedyren kan finnes i figur 1. I korthet ble bakteriecellene blir dyrket, høstet, lysert cellepelleten og RNA ekstrahert. Renset RNA blir deretter behandlet med DNase for å fjerne spor av DNA-molekyler som kan virke som templater for den reverse transkriptase. Spesifikke fluorescerende primere tilsettes til RNA hybridisert til området av interesse og deretter reverstranskribert, noe som resulterer i enkeltkjedet komplementært DNA (cDNA). En sekvense stigen er laget av tradisjonelle Sanger-sekvensering ved anvendelse av fluorescerende primere og separert på en denaturerende polyakrylamidgel sammen av cDNA-fragmenter primer-forlengelse. Den resulterendeGelen blir analysert ved sammenligning av de fluoriserende bånd, slik at identifikasjon av 5 'ender av interesse. Transkripsjonsutgangspunkter og områder for behandling blir så vurdert individuelt av sekvenssammenligninger.

Protocol

1. High Yield RNA Forberedelse RNA Isolation MERK: Høye konsentrasjoner av total RNA er nødvendig for primerekstensjonsreaksjon. Sentrifugekolonnesett som regel ikke gir mengden av RNA nødvendig (~ 5-16 ug i 5 ul volum). Derfor er rensing ved hjelp av syre guanidiniumtiocyanat-fenol-kloroform-ekstraksjon fremgangsmåte anbefales, er beskrevet nedenfor. MERK: Fenol er kreftfremkallende, giftig og etsende. Vennligst les sikkerhetsdatablad og bruke under en avtrekkshette med riktig beskyttelse! …

Representative Results

Som vist i figur 6, kan en primerekstensjonsreaksjon benyttes for å bestemme de transkripsjonelle startpunkter av transkripter av interesse, og kan bidra til å utlede promotorregioner (vanligvis identifisert ved -10 og -35 elementer). Den øverste (lengste) cDNA-fragment representerer den 5 'ende av mRNA og således lett kan kartlegges i forhold til sekvenserings-stige. Figur 6. Repre…

Discussion

Fluorescerende primer-ekstensjon er en enkel og hurtig metode for å bestemme den 5 'ende av RNA, enten for TSP- eller sekundær RNA-prosessering identifikasjon. På grunn av bruken av fluorescerende primere, kan reaksjonene bli satt opp og kjøre uten ytterligere sikkerhetsforholdsreglene (i motsetning til i tilfellet med radioaktivt merkede primere). Som prøvene blir detektert ved fluorescens, kan de bli avbildet mens elektroforese pågår som tillater rask analyse i forhold til radioaktive metoder hvor røntgenf…

Materials

Name	Supplier	Catalog Number(s)	Comment
AMV Reverse Transcriptase (20-25 U/µl)	NEB / Roche	NEB: M0277-T / Roche: 10109118001
DNase I (RNase free)	Ambion (life technologies)	AM2222
FastPrep-24 Instrument	MPBio	116004500
Fluorescently labeled primers	Biomers	n/a	5’ DY-681 modification of “ordinary” DNA oligonucleotides. Compatible dyes such as the LICOR IRDye 700/800 are also available from other suppliers such as IDTdna.
Li-Cor 4200 Sequencer incl. ImagIR Data collection software	Li-Cor		Product discontinued
NanoDrop 2000	Thermo Scientific
Nuclease free water	Ambion (life technologies)	AM9915G
Plasmid mini preparation kit	QIAGEN	12125
RapidGel-XL-40% Concentrate	USB	US75863
RNA STORAGE BUFFER	Ambion (life technologies)	AM7000
Roti-Aqua-P/C/I	Carl Roth	X985.3	Alternative: “Acid-Phenol:Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1)” from Ambion (AM9720)
SUPERase•In RNase Inhibitor	Ambion (life technologies)	AM2696
Thermo Sequenase fluorescently labelled primer cycle sequencing kit with 7-deaza-dGTP	GE Healthcare	RPN2538
TRIzol reagent	life technologies	15596-026
Zirconia/Silica Beads 0.1 mm	BioSpec	11079101z