Fluorescência Baseado Técnica Extensão Primer para determinar Transcriptional pontos de partida e de clivagem Sites de RNases<em> In Vivo</em

Summary

We here describe a fluorescence based primer extension method to determine transcriptional starting points from bacterial transcripts and RNA processing in vivo using an automated gel sequencer.

Abstract

A fluorescência baseada extensão do iniciador (FPE) é um método molecular para determinar pontos de partida da transcrição ou locais de processamento de moléculas de RNA. Isto é conseguido através de transcrição reversa do ARN de interesse, utilizando iniciadores marcados com fluorescência específicos e análise subsequente dos fragmentos de ADNc resultantes por electroforese em gel desnaturante de poliacrilamida. Simultaneamente, uma reacção de sequenciação de Sanger tradicional é executado sobre o gel para mapear as extremidades dos fragmentos de ADNc correspondentes às suas bases exactas. Em contraste com 5'-RACE (Amplificação Rápida de Extremidades de ADNc), no qual o produto deve ser clonados e sequenciados vários candidatos, a maior parte dos fragmentos de ADNc gerados por extensão do iniciador pode ser detectado em simultâneo uma corrida de gel. Além disso, todo o procedimento (a partir de transcrição reversa para análise final dos resultados) pode ser completada em um dia de trabalho. Ao utilizar os iniciadores marcados com fluorescência, a utilização de reagentes perigosos isótopo radioactivo marcadopode ser evitada e os tempos de processamento são reduzidos como produtos podem ser detectadas durante o processo de electroforese.

No protocolo seguinte, nós descrevemos um método de extensão do iniciador fluorescente in vivo para detectar de forma fiável e rápida extremidades 5 'dos RNAs para deduzir pontos de partida da transcrição e locais de processamento de RNA (por exemplo, por componentes do sistema de toxina-antitoxina) em S. aureus, E. coli e outras bactérias.

Introduction

A extensão do iniciador ¹ é um método molecular para determinar as extremidades 5 'de moléculas de RNA específicas até uma resolução de uma base. A vantagem de outros métodos, tais como 5'-RACE (amplificação rápida de extremidades de ADNc) é o tempo de resposta rápido e a capacidade de analisar facilmente uma mistura de diferentes comprimentos de moléculas de RNA.

Este método funciona por sujeição de moléculas de ARN para reacções de transcrição reversa, utilizando iniciadores fluorescentes específicos, gerando fragmentos de cDNA de determinados comprimentos. Estas moléculas de cDNA são executados juntamente com as reacções de sequenciação de Sanger tradicional ² em géis desnaturantes de poliacrilamida e podem ser detectadas pela sua fluorescência devida à utilização de iniciadores marcados com fluorescência. Os comprimentos dos fragmentos de cDNA são então avaliadas por comparação com a escada de sequenciação, permitindo que o mapeamento dos terminais 5 'de RNA.

Tradicionalmente, as reacções de extensão de iniciadores são utilizados em conjuntocom isótopos radioactivos para detectar moléculas de cDNA em películas de raios-X. Devido aos riscos de saúde, problemas de eliminação de resíduos e facilidade de manuseamento, os protocolos mais recentes utilizam fluorescência para a detecção da extensão do iniciador com sequenciadores automatizados, embora a sua sensibilidade é ligeiramente inferior. Usando primers marcados com fluorescência, o procedimento da marcação recorrentes podem ser omitidos, como iniciadores fluorescentes são estáveis ​​por um longo tempo (mais de um ano em nossas mãos).

O método aqui descrito utiliza um sequenciador automatizado de gel, mas com ligeiras modificações, sequenciadores capilares podem também ser utilizados para a separação e detecção de cDNA ^3. A natureza paralela de análise de gel faz com que seja possível detectar mesmo uma pequena quantidade de clivagem ou processamento de RNA. Outra vantagem é a elevada resolução deste método, como clivagem ou mesmo um tratamento de base terminal pode ser detectado.

No que diz respeito à detecção de clivagem de RNA ou de transformação, typically dois diferentes tipos de extensões de primer são distinguidos. Em um caso, o tratamento enzimático é realizado in vitro utilizando ARN purificado e enzima purificada, enquanto que no outro caso, o processamento é realizado in vivo, e o ARN resultante é purificado. Em ambos os casos, o ARN é sujeito a uma extensão de primer efectuada in vitro, no entanto, dependendo da fonte de RNA, o método é chamado tanto uma extensão do iniciador in vivo, in vitro ou in. No protocolo apresentamos aqui, nos concentrarmos apenas na extensão do iniciador in vivo, por causa da facilidade de utilização (não há proteínas purificadas necessário) e a possibilidade de determinar pontos de partida da transcrição e processamento ao mesmo tempo. No entanto, in vitro extensões de primer são, em princípio, criado da mesma maneira e este protocolo pode servir como um ponto de partida.

O método ilustrado aqui pode ser aplicado a muitas espécies de bactérias, desde que eles são passíveis de altapureza e elevado rendimento de preparação de ácidos nucleicos.

A pesquisa em nosso laboratório centra-se no âmbito regulatório da toxina-antitoxina (TA) Sistemas de ^4,5, um campo em que o método de extensão do primer é usado extensivamente. TA-sistemas são pequenos elementos genéticos presentes nos genomas procarióticos que consistem de uma proteína tóxica e estável endogenamente activa e uma proteína ou RNA antitoxina na maior parte instável, que neutraliza a toxicidade ^6,7. A actividade da toxina é por vezes exercida pela inibição da replicação, síntese da parede celular ou outros mecanismos, mas na maioria das vezes pela actividade de ARNase ^8,9. Tipicamente, a RNase especificidade é determinada através da realização de testes diferentes, um dos quais é o método de extensão do primer. Reacções de extensão de iniciadores são adequados para esta aplicação, como uma mistura de fragmentos de comprimento completo e clivados podem ser simultaneamente analisadas para determinar suas extremidades 5 '. Usando uma mistura de in vitro e in vivo em extensões de iniciadores, otoxina de clivagem específico de RNase, por exemplo, a especificidade de sequência pode ser determinada ^10-13.

Figura 1. Visão geral do procedimento de extensão do primer. As culturas bacterianas são incubados e tratados de acordo com as necessidades experimentais. O RNA total é extraído das células, tratadas com ADNase I para remover os vestígios de ADN e submetidos a uma reacção de transcrição inversa utilizando iniciadores fluorescentes específicos de ADN alvo produzindo cDNA. O ADN genómico ou plasmídeos são extraídos e subsequentemente utilizada para a fluorescentes reacções de sequenciação de Sanger para comparação do tamanho com fragmentos de cDNA. Produtos de extensão dos iniciadores são executados juntamente com os produtos de sequenciação de Sanger sobre um gel de poliacrilamida desnaturante de ureia e analisadas com um microscópio a laser e automatizado. A base de seqüenciamento que se alinha com a banda de cDNA é a last base da extremidade 5 'de cDNA (seta azul). Mais informações em Fekete, et al. ³ Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Uma visão geral de todo o processo de extensão do primer pode ser encontrada na Figura 1. Resumidamente, as células bacterianas são cultivadas, colhidas, o sedimento de células lisadas e o RNA extraído. RNA purificado é então tratado com ADNase I para remover vestígios de moléculas de ADN, que possam actuar como modelos para a transcriptase reversa. Iniciadores fluorescentes específicos são adicionados ao ARN, hibridados com a região de interesse e subsequentemente objecto de transcrição reversa, resultando numa única cadeia de ADN complementar (cDNA). Uma escada de sequenciação é criado por sequenciação de Sanger tradicional utilizando iniciadores fluorescentes e separados num gel de poliacrilamida desnaturante a par dos fragmentos de cDNA de extensão de iniciadores. A resultantegel é analisado por comparação das bandas fluorescentes, permitindo a identificação de terminais 5 'de interesse. Pontos de partida de transcrição e locais de processamento são, então, avaliados individualmente pela comparação de seqüências.

Protocol

1. High Yield RNA Preparação Isolamento de ARN NOTA: As elevadas concentrações de ARN total são necessários para a reacção de extensão do iniciador. Kits de coluna spin normalmente não produzem a quantidade de ARN necessária (~ 5-16 ug em 5 ul de volume). Portanto, recomenda purificação utilizando o método de extração de tiocianato-fenol-clorofórmio guanidina ácido, descrito abaixo. NOTA: O fenol é cancerígeno, tóxico e corrosivo. Por favor, leia as folhas de dados de segura…

Representative Results

Como representado na Figura 6, uma reacção de extensão do iniciador pode ser utilizado para determinar os pontos de partida da transcrição de transcritos de interesse e pode ajudar a deduzir regiões promotoras (tipicamente identificados por elementos de -10 e -35). O nível superior (mais longa) fragmento de cDNA representa o "fim do ARNm 5 e, portanto, pode ser facilmente mapeada quando comparada com a escada de sequenciação. <img alt="A Figura 6" src="/files/ft…

Discussion

Extensão do iniciador fluorescente é um método simples e rápido para a determinação extremidades 5 'dos ​​RNAs, quer para identificação TSP- ou processamento de RNA secundário. Devido ao uso de iniciadores fluorescentes, as reacções podem ser configurar e executar, sem precauções de segurança adicionais (ao contrário do caso de iniciadores marcados radioactivamente). Como as amostras são detectadas por fluorescência, que pode ser convertido em imagem, enquanto a electroforese está em progresso …

Materials

Name	Supplier	Catalog Number(s)	Comment
AMV Reverse Transcriptase (20-25 U/µl)	NEB / Roche	NEB: M0277-T / Roche: 10109118001
DNase I (RNase free)	Ambion (life technologies)	AM2222
FastPrep-24 Instrument	MPBio	116004500
Fluorescently labeled primers	Biomers	n/a	5’ DY-681 modification of “ordinary” DNA oligonucleotides. Compatible dyes such as the LICOR IRDye 700/800 are also available from other suppliers such as IDTdna.
Li-Cor 4200 Sequencer incl. ImagIR Data collection software	Li-Cor		Product discontinued
NanoDrop 2000	Thermo Scientific
Nuclease free water	Ambion (life technologies)	AM9915G
Plasmid mini preparation kit	QIAGEN	12125
RapidGel-XL-40% Concentrate	USB	US75863
RNA STORAGE BUFFER	Ambion (life technologies)	AM7000
Roti-Aqua-P/C/I	Carl Roth	X985.3	Alternative: “Acid-Phenol:Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1)” from Ambion (AM9720)
SUPERase•In RNase Inhibitor	Ambion (life technologies)	AM2696
Thermo Sequenase fluorescently labelled primer cycle sequencing kit with 7-deaza-dGTP	GE Healthcare	RPN2538
TRIzol reagent	life technologies	15596-026
Zirconia/Silica Beads 0.1 mm	BioSpec	11079101z