Флуоресценции основе удлинения праймера методики определения транскрипционных отправных точках и сайты расщепления РНКаз<em> В Vivo</em
Summary
We here describe a fluorescence based primer extension method to determine transcriptional starting points from bacterial transcripts and RNA processing in vivo using an automated gel sequencer.
Abstract
Флуоресценции основе удлинения праймера (ФПО) представляет собой молекулярный метод для определения транскрипционных отправные точки или обработки участки молекул РНК. Это достигается с помощью обратной транскрипции РНК интереса с использованием специфических флуоресцентно меченных праймеров и последующий анализ полученных фрагментов кДНК посредством денатурации электрофореза в полиакриламидном геле. Одновременно, традиционный реакции секвенирования Сэнгер запускается на гель для отображения концы фрагментов кДНК с их точными соответствующих баз. В отличие от 5'-RACE (быстрой амплификации концов кДНК), где продукт должен быть клонированной и несколько кандидатов секвенированной, основная часть фрагментов кДНК, порожденных удлинения праймера можно одновременно обнаружить в одной гелевой перспективе. Кроме того, вся процедура (с обратной транскрипцией до конечного анализа результатов) может быть завершена в течение одного рабочего дня. При использовании флуоресцентно меченных праймеров, использование опасных помечены радиоактивным изотопом реагентовможно избежать, и время обработки уменьшается, как продукты могут быть обнаружены во время процедуры электрофореза.
В следующем протоколе, мы опишем люминесцентные праймера метод расширения в естественных условиях, чтобы надежно и быстро обнаружить 5 'концы РНК вывести транскрипции отправные точки и участки для обработки РНК (например, с помощью системных компонентов токсина-антитоксина) в S. стафилококк, Е. палочка и другие бактерии.
Introduction
Удлинение праймера 1 представляет собой молекулярный метод для определения 5 'концы конкретных молекул РНК до одной базовой разрешением. Преимущество с другими методами, такими как 5'-RACE (быстрой амплификации концов кДНК) является быстро время обработки и способность легко анализировать смесь различных длин молекул РНК.
Этот метод работает, подвергая молекулы РНК с обратной реакций транскрипции с использованием специфических флуоресцентных праймеров, генерации кДНК фрагменты определенной длины. Эти молекулы кДНК работать параллельно с традиционными Сэнгер секвенирования реакций 2 на денатурирующих полиакриламидных гелей и могут быть обнаружены по их флуоресценции из-за использования флуоресцентно меченных праймеров. Длины фрагментов кДНК затем оценивали по сравнению с секвенирования лестницы, позволяя отображение на концах "5 РНК.
Традиционно праймеров реакции расширения используются в сочетаниис радиоактивными изотопами для обнаружения молекул кДНК на рентгеновских пленок. В связи с опасностями для здоровья, вопросы утилизации отходов и легкостью обработки, новые протоколы используют флуоресценцию для обнаружения удлинения праймера с автоматизированных секвенсоров, хотя их чувствительность несколько ниже. Использование флуоресцентно меченных праймеров, повторяющиеся процедуры радио-маркировка может быть опущен, как люминесцентные грунтовки устойчивы в течение длительного времени (более года в наших руках).
Способ описан здесь использует автоматизированную гель секвенсор, но с небольшими изменениями, капиллярные секвенсеры может быть также использован для разделения и обнаружения кДНК 3. Параллельный характер анализа гель дает возможность обнаружить даже небольшое количество расщепления РНК или обработки. Еще одним преимуществом является высокое разрешение этого метода, как терминал расщепления или обработки даже одной базе могут быть обнаружены.
В связи с обнаружением расщепления РНК или обработки, тypically два различных типа расширений праймеров различают. В одном случае, ферментативная обработка выполняется в пробирке с использованием очищенного РНК и очищенного фермента, в то время как в другом случае, обработка выполняется в естественных условиях, и полученную РНК очищали. В обоих случаях РНК подвергают удлинение праймера проводят в пробирке, однако, в зависимости от источника РНК, либо метод называют в пробирке или в удлинение праймера в естественных условиях. В протоколе приведем здесь, мы сосредоточены только на естественных удлинения праймера в, из-за легкости использования (не очищенных белков необходимо) и возможностью определения транскрипционные отправные точки и обработку, в то же время. Тем не менее, в пробирке расширения праймеров, в принципе, созданной тем же способом и этот протокол может служить в качестве отправной точки.
Способ, показанный здесь, могут быть применены к многих видов бактерий тех пор, пока они поддаются высокойподготовка нуклеиновых кислот чистота и высокодоходным.
Исследования в нашей лаборатории сосредоточена на нормативно рамки токсин-антитоксин (таблица) систем 4,5, поля в которой метод удлинения праймера широко используется. TA-системы представляют собой небольшие генетические элементы, присутствующие в прокариотических геномов, которые состоят из стабильного и активного эндогенно токсичного белка и в основном нестабильной белка или РНК антитоксина, что противодействует токсичности 6,7. Токсин активность иногда оказывает ингибирование репликации, синтеза клеточной стенки или других механизмов, но чаще всего по активности РНКазы 8,9. Как правило, РНКазы специфика определяется путем проведения различных тестов, одним из которых является метод удлинения праймера. Грунтовка реакции удлинительные хорошо подходят для такого применения, как смесь расщепленных фрагментов и полных длины могут быть одновременно анализируют, чтобы определить их 5'-концах. Используя сочетание в пробирке и в естественных расширений праймеров,конкретных токсин РНКазы декольте, например, последовательность специфичность может быть определена 10-13.
Рисунок 1. Обзор процедуры удлинения праймера. Бактериальные культуры инкубируют и лечение в соответствии с экспериментальными потребностей. Общую РНК экстрагировали из клеток, обработанных ДНКазы I, чтобы удалить следы ДНК и подвергали реакции обратной транскрипции с использованием конкретных целевых флуоресцентных праймеров ДНК, дающие кДНК. Геномную ДНК или плазмиды, извлекаются и впоследствии используется для люминесцентных Сангер секвенирования реакций для сравнения с размером фрагментов кДНК. Продуктов удлинени праймера которые проходят вдоль Сэнгер секвенирования продуктов на денатурирующем полиакриламидном геле мочевины и анализировали с автоматизированной лазерной и микроскопом. Секвенирование база, что линии с полосой кДНК является лаул основание 5'-конца кДНК (синей стрелкой). Более подробная информация в Фекете, и др. 3 Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Обзор всей процедуры удлинения праймера можно найти на рисунке 1. Коротко, бактериальные клетки культивируют, собирают, клеточный осадок лизируют и РНК экстрагируют. Очищенная РНК затем обрабатывали ДНКазой I, чтобы удалить следы молекул ДНК, которые могли бы действовать в качестве матриц для обратной транскриптазы. Конкретные флуоресцентные праймеры будут добавлены в РНК, гибридизации в области, представляющей интерес, а затем обратной транскрипции, в результате чего одноцепочечной комплементарной ДНК (кДНК). Секвенирование лестница создается традиционной Sanger секвенирования с использованием флуоресцентных праймеров и разделены на денатурирующего полиакриламидного геля наряду из праймеров фрагментов кДНК расширение. ПолученнуюГель анализируется путем сравнения флуоресцентные полосы, что позволяет идентифицировать 5 'концах интерес. Транскрипции отправные точки и участки обработки Затем оценивается индивидуально по сравнения последовательностей.
Protocol
Representative Results
Discussion
Расширение Люминесцентная грунтовка представляет собой простой и быстрый способ определения 5 'концы РНК, либо для TSP- или вторичной идентификации обработки РНК. Благодаря использованию флуоресцентных праймеров, реакции могут быть созданы и работают без дополнительных мер безопасн…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Anne Wochele for her assistance in the laboratory and Vera Augsburger for help with the automated gel sequencer. We thank the Deutsche Forschungsgemeinschaft for funding by grants BE4038/2 and BE4038/5 within the “priority programmes” SPP1316 and SPP1617.
Materials
| Name | Supplier | Catalog Number(s) | Comment |
| AMV Reverse Transcriptase (20-25 U/µl) | NEB / Roche | NEB: M0277-T / Roche: 10109118001 | |
| DNase I (RNase free) | Ambion (life technologies) | AM2222 | |
| FastPrep-24 Instrument | MPBio | 116004500 | |
| Fluorescently labeled primers | Biomers | n/a | 5’ DY-681 modification of “ordinary” DNA oligonucleotides. Compatible dyes such as the LICOR IRDye 700/800 are also available from other suppliers such as IDTdna. |
| Li-Cor 4200 Sequencer incl. ImagIR Data collection software | Li-Cor | Product discontinued | |
| NanoDrop 2000 | Thermo Scientific | ||
| Nuclease free water | Ambion (life technologies) | AM9915G | |
| Plasmid mini preparation kit | QIAGEN | 12125 | |
| RapidGel-XL-40% Concentrate | USB | US75863 | |
| RNA STORAGE BUFFER | Ambion (life technologies) | AM7000 | |
| Roti-Aqua-P/C/I | Carl Roth | X985.3 | Alternative: “Acid-Phenol:Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1)” from Ambion (AM9720) |
| SUPERase•In RNase Inhibitor | Ambion (life technologies) | AM2696 | |
| Thermo Sequenase fluorescently labelled primer cycle sequencing kit with 7-deaza-dGTP | GE Healthcare | RPN2538 | |
| TRIzol reagent | life technologies | 15596-026 | |
| Zirconia/Silica Beads 0.1 mm | BioSpec | 11079101z |
References
- Simpson, C. G., Brown, J. W. Primer extension assay. Methods Mol. Biol. 49, 249-256 (1995).
- Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 74, 5463-5467 (1977).
- Fekete, R. A., Miller, M. J., Chattoraj, D. K. Fluorescently labeled oligonucleotide extension: a rapid and quantitative protocol for primer extension. Biotechniques. 35, 90-94 (2003).
- Schuster, C. F., et al. Characterization of a mazEF Toxin-Antitoxin Homologue from Staphylococcus equorum. J. Bacteriol. 195, 115-125 (2013).
- Nolle, N., Schuster, C. F., Bertram, R. Two paralogous yefM-yoeB loci from Staphylococcus equorum encode functional toxin-antitoxin systems. Microbiology. 159, 1575-1585 (2013).
- Yamaguchi, Y., Park, J. H., Inouye, M. Toxin-antitoxin systems in bacteria and archaea. Annu. Rev. Genet. 45, 61-79 (2011).
- Schuster, C. F., Bertram, R. Toxin-antitoxin systems are ubiquitous and versatile modulators of prokaryotic cell fate. FEMS Microbiol. Lett. 340, 73-85 (2013).
- Goeders, N., Van Melderen, L. Toxin-antitoxin systems as multilevel interaction systems. Toxins. 6, 304-324 (2014).
- Yamaguchi, Y., Inouye, M. mRNA interferases, sequence-specific endoribonucleases from the toxin-antitoxin systems. Progress in molecular biology and translational science. 85, 467-500 (2009).
- Park, J. H., Yamaguchi, Y., Inouye, M. Bacillus subtilis MazF-bs (EndoA) is a UACAU-specific mRNA interferase. FEBS Lett. 585, 2526-2532 (2011).
- Zhu, L., et al. et al.Staphylococcus aureus MazF specifically cleaves a pentad sequence, UACAU, which is unusually abundant in the mRNA for pathogenic adhesive factor SraP. J. Bacteriol. 191, 3248-3255 (2009).
- Zhu, L., et al. The mRNA interferases, MazF-mt3 and MazF-mt7 from Mycobacterium tuberculosis target unique pentad sequences in single-stranded RNA. Mol. Microbiol. 69, 559-569 (2008).
- Fu, Z., Donegan, N. P., Memmi, G., Cheung, A. L. Characterization of MazFSa, an endoribonuclease from Staphylococcus aureus. J. Bacteriol. 189, 8871-8879 (2007).
- Marmur, J. A procedure for the isolation of deoxyribonucleic acid from micro-organisms. J. Mol. Biol. 3, 208-218 (1961).
- Emory, S. A., Belasco, J. G. The ompA 5′ untranslated RNA segment functions in Escherichia coli as a growth-rate-regulated mRNA stabilizer whose activity is unrelated to translational efficiency. J. Bacteriol. 172, 4472-4481 (1990).
- Cole, S. T., Bremer, E., Hindennach, I., Henning, U. Characterisation of the promoters for the ompA gene which encodes a major outer membrane protein of Escherichia coli. Mol. Gen. Genet. 188, 472-479 (1982).
- Schleifer, K. H., Kilpper-Bälz, R., Devriese, L. Staphylococcus arlettae sp. nov., S. equorum sp. nov. and S. kloosii sp. nov.: Three New Coagulase-Negative, Novobiocin-Resistant Species from Animals. Syst. Appl. Microbiol. 5, 501-509 .
- Yu, H., Goodman, M. F. Comparison of HIV-1 and avian myeloblastosis virus reverse transcriptase fidelity on RNA and DNA templates. J. Biol. Chem. 267, 10888-10896 (1992).
- Ying, B. W., Fourmy, D., Yoshizawa, S. Substitution of the use of radioactivity by fluorescence for biochemical studies of RNA. RNA. 13, 2042-2050 (2007).
