Utilizzo plusTipTracker software per misurare Microtubulo Dynamics in<em> Xenopus laevis</em> coni di crescita
Summary
Il pacchetto software basato su MATLAB open source, plusTipTracker, può essere utilizzato per analizzare serie di immagini di + TIP fluorescenza marcata per quantificare la dinamica dei microtubuli.
Abstract
Microtubuli (MT) più-end-tracking proteine (+ TIP) localizzano alle crescenti più-estremità di MTS e regolano le dinamiche MT 1,2. Uno dei suggerimenti più noti e ampiamente utilizzati + per l'analisi dinamica MT è l'End-binding protein, EB1, che lega tutte le crescenti MT plus-end, e, quindi, è un marker per MT polimerizzazione 1. Molti studi del comportamento EB1 entro coni di crescita hanno utilizzato in termini di tempo e di parte assistita da computer, i metodi a mano-tracking per analizzare singoli MT 1-3. Il nostro approccio è quello di quantificare i parametri globali della dinamica MT utilizzando il pacchetto software, plusTipTracker 4, a seguito dell'acquisizione di alta risoluzione, immagini in diretta di EB1 taggato in coltura coni di crescita embrionali 5. Questo software è un basato su MATLAB, open-source, pacchetto user-friendly che combina il rilevamento automatico, il monitoraggio, la visualizzazione e l'analisi per i film di fluorescenza marcata + TIP. Qui, vi presentiamo il protocollo per l'utilizzo di plusTipTRacker per l'analisi delle comete fluorescenza marcata + TIP in colture di Xenopus laevis coni di crescita. Tuttavia, questo software può anche essere utilizzato per caratterizzare la dinamica MT in vari tipi di cellule 6-8.
Introduction
L'obiettivo di questo metodo è quello di ottenere informazioni quantitative in materia di microtubuli (MT) più–end inseguimento dinamica a vivere coni di crescita di proteine (+ TIP). MT + TIP sono un gruppo di proteine che localizzano ai più-end di MTS 9,10. Essi svolgono una serie di funzioni per regolare i parametri di instabilità dinamica MT 11, compresi i tassi di polimerizzazione, catastrofe, e soccorso. Un metodo ben utilizzato per analizzare le dinamiche MT è quello di monitorare il comportamento del EB1 TIP +, che si lega specificamente alla crescente MT plus-conclude 1,12. EB1 è conosciuto per reclutare diverse altre proteine per crescere MT plus-conclude 13,14, ed è stato recentemente istituito come un fattore di maturazione MT 15, MT promuovere sia la crescita e la frequenza catastrofe 15,16.
Molti studi di dinamica MT all'interno di coni di crescita hanno utilizzato metodi di mano-tracking per misurare i cambiamenti nelle dinamiche EB1-GFP nel tempo 1-3, come EB1 localizatia MT, più-end possono essere usati come marker per MT polimerizzazione. Uno dei principali vantaggi per l'esame comete EB1-GFP come proxy per la crescita MT è che la dinamica MT possono essere misurati anche nelle regioni di sovrapposizione significativa MT. Mentre il metodo di tracciamento a mano comete EB1-GFP ha fornito indicazioni utili in MT comportamenti 1-3, è che richiede tempo e può essere prevenuto. Inoltre, come la crescita aberrante comportamenti cono sono probabilmente il risultato di cambiamenti minute dinamica del citoscheletro, analizzando solo un piccolo sottoinsieme di MTS (di solito necessario quando la mano-tracking) possono perdere informazioni significative.
Così, misuriamo globali parametri delle dinamiche MT utilizzando il pacchetto software, plusTipTracker 4, dopo l'acquisizione ad alta risoluzione, immagini in diretta di EB1 taggato in coltura coni di crescita embrionali 5. Questo software, sviluppato in Danuser Lab, è stata utilizzata in diversi studi che caratterizzano dinamiche MT in vari tipi di cellule 6-8. Si tratta di un open-source, cier-amichevole, pacchetto basato su MATLAB, che comprende il rilevamento automatico, il monitoraggio, la visualizzazione e l'analisi per i film di fluorescenza marcata + TIP. Una lunga lista di parametri specifici della dinamica MT sono calcolati da questo software (vedi riferimento 4 per i dettagli), ma per l'analisi delle dinamiche MT in coni di crescita, i parametri più utili sono la velocità pista crescita MT (in micron / minuto), traccia la crescita durata (in secondi), e la lunghezza della traccia crescita (in micron). Il software può essere scaricato direttamente dal sito web Danuser Lab (sotto "Software"). Mentre il Danuser Lab supporta attualmente una nuova interfaccia per il monitoraggio TIP + analisi, che è integrata in un pacchetto software chiamato u-track 2.0, l'originale, software stand-alone rimarrà disponibile. Gli algoritmi sottostanti tra i due programmi sono uguali (almeno dal 2014), con solo una differenza di uscite dell'interfaccia e di analisi. Per l'utente inesperto con poco MATLAB e / o l'analisi computazionale esperimentiza, plusTipTracker ha più caratteristiche user-friendly, tra cui le uscite dei parametri statistici automatizzati.
Qui, descriviamo la procedura per l'analisi di immagini dinamiche EB1-GFP in coltura Xenopus laevis coni di crescita. Questo protocollo è stato utilizzato in un recente documento esamina le dinamiche MT 17. Per istruzioni dettagliate relative coni di crescita coltura esprimono EB1-GFP Vedi anche Lowery et al. 2012 5. Anche se questo documento è concentrata principalmente sull'esame dinamiche EB1-GFP in coni di crescita, lo stesso protocollo può essere utilizzato per altri tipi di cellule 17. Per tutti i tipi di cellule, l'intervallo di tempo tra i fotogrammi deve essere compresa tra 0,5-2 sec per il monitoraggio ottimale + TIP. Un intervallo di tempo di fino a 4 secondi tra i frame è possibile, ma questo aumento risultati in tempo intervallo di tracking error supplementari.
Protocol
Representative Results
Discussion
PlusTipTracker fornisce una semplice interfaccia grafica per rilevare rapidamente e automaticamente quasi tutti visibili comete EB1-GFP in un cono di cellulare o di crescita, collegare le comete in tracce, e calcolare i parametri MT. Altre pubblicazioni hanno riportato la progettazione di simili tipi di software (per esempio, Marx et al. Analisi quantitativa anche utilizzato delle dinamiche EB1 taggati in coni di crescita 18). Ma, questo software sembra essere unico nella sua facilità di accesso, in…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Dr. Gaudenz Danuser and members of his lab for creating the plusTipTracker software and for helpful discussion regarding using the software, in particular Maria Bagonis and Sebastien Besson. We especially thank the Boston College Media Center for their assistance and support in the creation and editing of the video. We also thank members of the Lowery Lab for useful discussions and constructive criticism, and Abigail Antoine for proof-reading the manuscript. This work was funded by an NIH R00 MH095768 award to LAL.
Materials
| plusTipTracker software | Danuser Lab | http://lccb.hms.harvard.edu/software.html | This software may be hosted by another website in the future. If the listed site does not exist, search "Danuser Lab Software" on a web search engine to find the site. |
| Matlab software | Mathworks | http://www.mathworks.com/products/matlab/ |
References
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