एक मॉडल के रूप घ्राण प्रणाली axonal विकास पैटर्न और आकृति विज्ञान का अध्ययन करने के लिए<em> Vivo</em
Summary
We describe a protocol for in vivo labeling of olfactory sensory neurons by electroporation and subsequent confocal laser-scanning or multiphoton microscopy to visualize neuronal morphology and its development over time.
Abstract
The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of the olfactory epithelium continuously give rise to new sensory neurons that extend their axons into the olfactory bulb, where they face the challenge to integrate into existing circuitry. Because of this particular feature, the olfactory system represents a unique opportunity to monitor axonal wiring and guidance, and to investigate synapse formation. Here we describe a procedure for in vivo labeling of sensory neurons and subsequent visualization of axons in the olfactory system of larvae of the amphibian Xenopus laevis. To stain sensory neurons in the olfactory organ we adopt the electroporation technique. In vivo electroporation is an established technique for delivering fluorophore-coupled dextrans or other macromolecules into living cells. Stained sensory neurons and their axonal processes can then be monitored in the living animal either using confocal laser-scanning or multiphoton microscopy. By reducing the number of labeled cells to few or single cells per animal, single axons can be tracked into the olfactory bulb and their morphological changes can be monitored over weeks by conducting series of in vivo time lapse imaging experiments. While the described protocol exemplifies the labeling and monitoring of olfactory sensory neurons, it can also be adopted to other cell types within the olfactory and other systems.
Introduction
The lifelong turnover of sensory neurons distinguishes the olfactory system from many other sensory and neuronal systems1,2. Newly formed sensory neurons are continuously generated in the basal portion of the olfactory epithelium3 and extend their axons into the olfactory bulb, the first relay station of the olfactory system4. However, the cellular and molecular mechanisms controlling the formation and maintenance of the olfactory map are far from being fully understood4,5.
Here, we describe a protocol for labeling sensory neurons of the olfactory organ of larval X. laevis by in vivo electroporation of fluorophore-coupled dextrans. The presented protocol allows visualization of axonal morphology and connectivity, track axonal development over time and study mechanisms regulating axonal wiring and guidance.
Electroporation is a well established method to introduce charged macromolecules, like dextran-coupled dyes and DNA, into cells6,7. The cell membrane is permeabilized by application of short voltage pulses and the molecules are electrophoretically delivered into the cytosol8. Spatially restricted electroporation using a micropipette permits selective labeling of cells including neurons and has been applied in various neuronal systems including the visual system of X. laevis9,10.
We show how the electroporated animals can be used to study axonal growth patterns and morphology in living animals using confocal laser-scanning or multiphoton microscopy. The described procedure allows identifying the coarse topology of axonal projections of sensory neurons of the main and accessory olfactory system11,12. Using in vivo time lapse imaging, it is also suitable to supervise the glomerular connections of single mature sensory neurons, and to monitor the evolution of the axonal projection patterns of immature sensory neurons12. The described protocol can be applied to investigate the structure and formation of olfactory circuits in the intact animal and can be adapted to other cell types within the olfactory and other neuronal systems.
Protocol
Representative Results
Discussion
यहाँ वर्णित प्रयोगात्मक प्रक्रिया लार्वा एक्स की घ्राण अंग की लेबलिंग संवेदी न्यूरॉन्स की अनुमति देता है फ्लोरोफोरे युग्मित dextrans और रहने वाले पशु में संवेदी अक्षतंतु विकास के बाद के दृश्य की electroporation द्वारा laevis. इन विवो electroporation के मापदंडों से अलग यह लेबल संवेदी न्यूरॉन्स की संख्या को नियंत्रित करने के लिए संभव है. यह बहुत कम या यहां तक कि एकल कक्षों एक संवेदी उपकला, के न्यूरॉन्स के बड़े समूहों लेबल करने के लिए इस तरह संभव है.
यह micropipette विशेषताओं और electroporation दालों के बारे में विशेष रूप से सतर्क रहने के लिए महत्वपूर्ण है न्यूरोनल लेबलिंग का विस्तार वांछित सुनिश्चित करने के लिए. हायर पिपेट resistances और वोल्टेज स्पंद आयाम, अवधि और repetitions की संख्या में कमी और अधिक व्यापक लेबलिंग का कारण बन सकता पिपेट resistances और उच्च वोल्टेज स्पंद आयाम, अवधि और दालों की संख्या कम है, जबकि लेबल कोशिकाओं की मात्रा को कम कर सकते हैं. गुelectroporation के लिए फ्लोरोसेंट dextrans की ई उपयोग लागू सेटिंग्स उपयुक्त हैं यदि तत्काल दृश्य प्रतिक्रिया प्रदान करता है. सावधान रहें कि आयाम, अवधि और संभावित सेल नुकसान हो या मौत भी 17 सेल कर सकते हैं प्रोटोकॉल में प्रदान मूल्यों से अधिक है कि दालों की संख्या के लिए मानकों का प्रयोग. Micropipettes के भरा हुआ या टूट टिप्स भी सफल electroporation के बाधा कर सकते हैं.
एक्स की घ्राण अंग में vivo electroporation में postmetamorphotic मेंढक की त्वचा मुश्किल है और आसानी से एक micropipette के साथ प्रवेश नहीं किया जा सकता क्योंकि laevis लार्वा चरणों तक सीमित है. neuronal प्रक्रियाओं के vivo दृश्य गहरी मस्तिष्क क्षेत्रों में या रक्त वाहिकाओं से उत्तेजना / उत्सर्जन प्रकाश के प्रकीर्णन द्वारा बाधा जा सकता है. इस समस्या की वजह से एक बड़ा मस्तिष्क को उच्च लार्वा चरणों में विशेष रूप से स्पष्ट हो जाता है और ठीक axonal प्रक्रियाओं की स्पष्ट पहचान और अधिक कठिन बना शोर संकेत हो सकता है.
<p= "jove_content"> प्रस्तुत प्रोटोकॉल परमिट वर्ग पूरे सेल पैच में लेबलिंग की तरह, पशु विदारक लेबलिंग के दौरान कोशिकाओं को नुकसान पहुँचाए, ऊतक स्लाइस तैयारी या वैकल्पिक तरीकों के लिए आवश्यक के रूप में ऊतक फिक्सिंग बिना बरकरार घ्राण प्रणाली में संवेदी न्यूरॉन्स कल्पना करने के लिए -clamp प्रयोगों 18. इन विवो समय चूक इमेजिंग के साथ कुछ या एकल संवेदी न्यूरॉन्स की लेबलिंग के संयोजन है, यह लंबे समय के अंतराल पर एक परिपक्व संवेदी न्यूरॉन्स की केशिकागुच्छीय कनेक्शन कल्पना करने के लिए संभव है. इस तरह से यह कई सप्ताह से अधिक अपरिपक्व संवेदी न्यूरॉन्स की axonal प्रक्षेपण पैटर्न के विकास पर नजर रखने के लिए भी संभव है. यह रहने वाले पशु में एकल axons की विकास पैटर्न की निगरानी की अनुमति देता है के रूप में यह दूसरा विकल्प विशेष रूप से दिलचस्प है. इस अक्षतंतु मार्गदर्शन और pathfinding कि नियंत्रण सेलुलर और आणविक तंत्र की जांच करने के लिए संभावना को खोलता है. Odorant रिसेप्टर अभिव्यक्ति सहित कई कारकों, विभिन्न axoएन मार्गदर्शन अणुओं और संवेदी न्यूरॉन्स की odorant प्रेरित / सहज गतिविधि संवेदी न्यूरॉन अक्षतंतु 4,5 का लक्ष्य खोज को विनियमित करने के लिए दिखाया गया है.प्रोटोकॉल के आवेदन घ्राण संवेदी न्यूरॉन्स तक ही सीमित नहीं है, लेकिन यह भी जैसे अन्य प्रकार की कोशिकाओं का अध्ययन करने के लिए लागू किया जा सकता है., विकासशील मस्तिष्क या घ्राण बल्ब की मित्राल कोशिकाओं की तंत्रिकाजन्य क्षेत्रों की / पूर्वज स्टेम सेल. इसके अलावा प्रदर्शन तकनीक भी लेबल न्यूरॉन और / या जुड़े circuitry के 7,19 के बारे में कार्यात्मक जानकारी पाने के लिए झिल्ली पारगम्य कैल्शियम रंजक कैल्शियम संवेदनशील dextrans साथ संयोजन में इस्तेमाल किया या इंजेक्शन जा सकता है. dextrans लिए युग्मित fluorophores की एक विस्तृत श्रृंखला की उपलब्धता कई व्यक्ति की कोशिकाओं या अलग अलग रंग के साथ आबादी की लेबलिंग परमिट. इसके अलावा फ्लोरोसेंट प्रोटीन के लिए उदाहरण एन्कोडिंग के लिए डीएनए समाधान, प्लाज्मिड, electroporation के लिए उपयुक्त है और आगे versatili वृद्धि कर सकते हैंTy और तकनीक 6 की उपयोगिता. प्रोटोकॉल आगे dextrans और डीएनए या आरोप लगाया morpholinos के संयुक्त electroporation के जीन अभिव्यक्ति 13,17 हेरफेर करने के लिए अनुमति देने के लिए बढ़ाया जा सकता है.
वर्णित विधि निश्चित रूप से जटिल और कशेरुकी घ्राण प्रणाली में axonal मार्गदर्शन विनियमित कि अभी भी पूरी तरह समझ नहीं प्रक्रियाओं की जांच के लिए एक नए उपकरण का प्रतिनिधित्व करता है.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by DFG Schwerpunktprogramm 1392 (project MA 4113/2-2), cluster of Excellence and DFG Research Center Nanoscale Microscopy and Molecular Physiology of the Brain (project B1-9), and the German Ministry of Research and Education (BMBF; project 1364480).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| SZX16 | Olympus | stereomicroscope with fluorescent illumination | |
| Axon Axoporator 800A | Molecular Devices | single cell electroporator | |
| ELP-01D | npi electronic | electroporator | |
| MMJ | Märzhäuser Wetzlar | manual micromanipulator | |
| P-1000 | Sutter | Horizontal micropipette puller | |
| G150F-4 | Warner Instruments | glass capillaries for electroporation pipette fabrication; internal filament makes backfilling easier | |
| Alexa 488-dextran 10kD | Life Technologies | D22910 | |
| Alexa 546-dextran 10kD | Life Technologies | D22911 | |
| Alexa 568-dextran 10kD | Life Technologies | D22912 | |
| Alexa 594-dextran 10kD | Life Technologies | D22913 | |
| TMR-dextran 3kD (micro-Ruby) | Life Technologies | D7162 | |
| microloader pipette tips | eppendorf | 930001007 | |
| tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate) | Sigma-Aldrich | E10521 | anesthetic; use gloves |
| A1-MP | Nikon | multiphoton microscope | |
| LSM 780 | Zeiss | confocal microscope | |
| Imaris | Bitplane | alternative software for neuronal tracing |
References
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