Recent improvements in organotypic brain slice preparations have permitted their exploitation for biotechnological applications. Organotypic slices maintain local structural characteristics of in vivo biology, including functional synaptic connections. Here we present a regioselective biolistic delivery method to label and genetically manipulate these slices.
In vivo biyoloji birçok yönlerini koruyarak DNA transfeksivonu biyolojik bilimler ve organotipik beyin dilim hazırlıkları yapılan son gelişmeler ile çok değerli olmuştur, çeşitli heterolog genlerin etkisi böylece kolayca incelenmiştir olabilir. Geleneksel transfeksiyon yöntemleri gibi düşük verim ve canlılığı önemli kayıplara da zorluklarla dolu olmuştur hangi terminal farklılaşmış nöronların geçiştirilmesi için giderek artan bir ilgi olmuştur. Biyolistik transfeksiyon, memeli dokularında kullanmak için uygun olduğunu, bu zorlukların pek çoğu, ancak son zamanlarda bu teknik, modifiye edilmiş aşmak olabilir.
Gaz odasına modifikasyonlar gen tabancası ateşleme doğruluk gelişmiş transfeksiyon ve verimlilik kaybına neden olmaksızın daha düşük gaz basınç altında (50 psi) kullanımına imkan veren penetrasyon derinliklerinde olan artış yanı sıra, pa odaklanmış bir regioselektif yayılmasını izin adres3 mm dahilinde rticles. Buna ek olarak, bu teknik, anlaşılır ve hızlı sıkıcı mikroenjeksiyon daha yapılmasıdır. Epizomal sentezleme, 24 saat içinde tespit edilebilir ve hücrenin hayatta kalma, daha iyi ya da geleneksel yöntemlere en azından eşit olduğu gösterilmiştir burada geçici ve kararlı sentezlenmesi için her ikisi de nanopartikül bombardımanı ile mümkündür. Ancak bu teknik, bir çok önemli bir avantajı vardır: anatomik olarak heterolog gen etkilerini izole etmek için imkan tanıyarak tek bir ölçülü yarıçapı içinde lokalize olduğu transfeksiyon izin verir. Burada geliştirilmiş bir gen tabancası kullanarak transfeksiyonunu regioseçici için canlı yetişkin organotipik dilimleri hazırlamak ve bunları göndermek için derinlemesine bir protokol mevcut.
Başlangıçta biyolistik tekniği, "biyolojik balistik" için bir turn-of-deyim, bitki hücreleri 1 içine parçacık-aracılı gen transferi için kurulmuştur. Hücre dönüşümünün fiziksel olarak bu yöntem, örneğin, DNA ya da boyalar gibi yüklerin teslim etmek amacıyla geçirgen hücre zarlarının fiziksel engellerin üstesinden gelmek için yüksek hızda mikro veya nano-tanecikleri hızlandırır. Bu spesifik bir ligand-reseptör ve / ya da hücre yüzey membranları de biyokimyasal özelliklerine bağlı değildir, çünkü, partikül aracılı gen transferi, hali hazırda, Organotipik beyin kesitleri gibi biyolojik sistemleri çeşitli uygulanabilir.
In vivo biyoloji 2-4 ilgilendiren birçok anatomik ve biyokimyasal özelliklerini korumak beri kullanmakta organotipik dilimleri vitro platformlarda diğer üzerinde avantajlara sahip. Dilimler çoğunlukla onlar kökenli ve preser nerede gelen yerel mimari özelliklerinin korunmasınörokimyasal aktivite ve sinapsların bağlantı ettik. Temel araştırma beyin dilimlerinin kullanımı, ve ilaç çalışmalarında, eş zamanlı olarak ölçer ve bağlam 3,5-7 gibi in vivo beyin nörobiyolojik davranışlarını kontrol etmek mümkündür biyoteknolojik manipülasyon sayısı artmıştır. Organotipik dilim-bazlı analiz sistemlerinin kullanılması için önemli bir avantajı, kolay bir deney kontrolü sağlar ve hücre dışı durumlar kesin manipülasyonlara olanak sağlamasıdır.
Verimli bir, Organotipik dilim kültür sistemleri gibi beyin bölgelerinin çeşitli kurdu, ancak korteksi, omurilik ve beyincik 8-10, bunlarla sınırlı değildir edilmiştir. Ayrıca, alt kültürleri olarak bir dizi uzak beyin bölgeleri boyunca hem de nöronlar ve patolojik hücreler arası iletişime 11,12 arasında değerlendirilmesine imkan vermektedir ki, ispat edilmiştir. Birçok protokolleri zaten s kurulmuşturuccessfully kültür Organotipik dilimleri ve uzun vadede kalıcılığı korumak ve birçok yeni çalışmalar şimdi 13 membran arabirim yöntemleri ve çeşitli değişiklikler kullanmaktadır. Bu ilke, gözenekli bir zar filtre üzerinde dilimleri yerleştirerek orta ve Küvözün nemli bir atmosferde arasındaki ara yüzeyde Organotipik dilim korur. Orta Böylece kılcal hareket yoluyla organotipik dilimleri beslemek için yeterli besin sağlayabilir. Tipik haliyle dilimleri erken doğum sonrası hayvanlardan elde edilmiştir (- 9 günlük 3 P3 – 9). Ancak, bu dilimlerden beyin dokuları hücresel plastisite yüksek düzeyde gösterilecek ve canlı kültürleri elde etmek yararlı mekanik streslerin doğal bir direnç var, henüz olgun sinapslar ve Nöroanatomik devresi tamamen yaşı 2 ila 3 hafta kadar in vivo gelişmiş değil 14. Örneğin, önceki gözlemler P0 ile elde edilen hipokampal dilimleri göstermişti – 1 yenidoğanlar yüksek VIAB rağmenle hazırlanması sonrasında, yavaş yavaş bazı morfolojik özellikleri kaybetti. Esasen, yaşlı hayvanlarda 15,16 den organotipik kültürlere kıyasla-farklılaştığı de daha fazlaydı olgunlaşmamış hücreler düşündüren uzun vadeli kültürler için uygun olduğu gösterilmiştir. Bu nedenle bizim yöntem olgunlaşma ve mimari gelişim onların terminal safhaya 13,17-21 ulaşmış hangi yetişkin organotipik beyin dilimleri için optimize edilmiştir. Bununla birlikte, bu yöntem, aynı zamanda, yenidoğan ve çocuk Organotipik dilim için uygundur.
Canlı organotipik dilimleri üretilen sonra dilim içeren tüm plaka biolistik montaj getirildi ve teslimat ve transfeksiyonunu regioseçici sunulabilir. (Dokuya açıklığından) doğrudan dilimleri üzerine, 10 mm'lik bir mesafede 90 ° yönlendirilmiş (Şekil 1 'de tarif edildiği gibi) gen tabancası Uygun montaj, 40 nm hızlı biyolistik gitmek verirld parçacık kargoları kaplı. Bu tür boyalar ve floresan bir DNA vektörleri gibi bu yüklerin, hem de ilgili herhangi bir gen, hali hazırda kolaylıkla uygulanabilir dilimlere teslim edilir. Bu nedenle bu yöntem, bir bölge seçici bir şekilde sunmak için gerekli protokolü tanımlamaktadır, uygun bir Organotipik beyin dilimler halinde kargo ile kaplanmış altın nano partiküller. Gen namlu ve en uygun montaj Şekil 1'de görülebilir. Geliştirilmiş namlu ve nanoparçacık balistik ilgili daha fazla bilgi için, ve ark. 17 O'Brien bakınız.
Sonraki iyileştirmeler aynı zamanda, kullanıcının mikro-taşıyıcı Yük Miktarı (MLQ) gibi tanımlanmıştır hedef alan başına iletilen altın miktarı uygun olarak koşullarının optimize edilmesi, ve DNA yükleme oranı olarak tanımlanan altın mg'ı başına yüklü DNA miktarını belirlemek için endikedir (DLR). Altın parçacıklar üzerine DNA çökelmesi ve gerçek gen tabancası 'kartuşlarını içermektedir Tefzel boru içine yükleme önce9 ;, dokularda ve koşullar arasında biraz farklı olabilir, her bir transfeksiyon için gerekli olan DNA ve altın miktarını hesaplamak için gerekli olan (oran 1 ila 1 mg altın ve 1 ug DNA arasında olmalıdır: 5). Bu şekilde, aksi takdirde, DNA ile kaplanmış altın partikülleri artış doku hasarı ve sitotoksiklik ile de biyolistik formanın homojenliği azaltabilecek beklenenden aglomerasyon, daha büyük oluşturarak birbirine bağlı olabilir dlr MLQ doğru oranını hazırlamak için hayati önem taşımaktadır.
Bu yöntem biolistik teslim son gelişmeleri, test edilmiş ve yenidoğan çocuk ve yetişkin organotipik beyin dilimleri için mükellef olduğu belirlenen edilmiştir gösterir. Bundan başka, gen tabancası namlu indirgenmiş biyolistik yayılmasını yararlanılarak, kullanıcı artık seçici olarak beyinde dakik bir bölgeyi transfekte edebilmektedir. Uygun enkübasyon süresinden sonra, 24 ile 48 arasında maksimum fiyat ulaşır floresan proteinleri ifadesaat, epifluoresan ve konfokal mikroskobu ile görülebilir. Bu flüoroforlar biyolojik ilgili yapıların içinde morfolojik analizi ve bireysel hücrelerin lokalizasyonu izin verir. Bununla birlikte, diğer heterolog genler tarafından Organotipik dilimlerin bölge seçici modülasyonu, aynı zamanda, bu preparatlar için uygun başka herhangi bir test ile izlenebilir. Lokalize gen aktarımı için mümkün olan bir çalışma stratejisi, Şekil 2'de sunulmuştur.
Protokol gelişmiş bir gen tabancası kullanılarak erişkin organotipik dilimler halinde boyalar ve genetik materyaller sunmak için yaklaşımlar anlatılmaktadır. Esasen, boya çeşitleri ve olası genlerin biyolojik çeşitlilik sorular geniş bir yelpazede cevap bu yöntem çok yönlü ve uygun hale. Belirli bir beyin bölgesinde, bu durumda, ikinci bölge seçici bir dağıtım yöntemi, bir biyolojik olarak uygun bir mimari içinde lokalize alanlarında heterolog gen düzenlenmesi gibi deney için yeni yollar açılmadan önce kolayca uygulanabilir değildir. Daha önce bu yöntem birçok hafta 13 için daha iyi şekilde hücre yaşamım ve heterolog gen ekspresyonu gösterdi olgun sinaps tamamen oluşturulur yetişkin Organotipik dilimleri hakkında kullanılabileceğini belirledik. Memeli beyin için yeni ve geliştirilmiş bir kültür koşulları gibi diğer dokuların ile birlikte, genetik bölge seçici modülasyon kullanımı Biyokimyasal geniş bir yelpazesi için yararlı olacakmical analiz eder.
Biz başkaları 24 tarafından belirtildiği burada ve daha önce vurgulamak olacaktır olarak, birçok farklı faktör kolayca biolistik teslim doğruluğunu ve güvenilirliğini etkileyebilir. İlk olarak, boyalar ya da DNA'ya bağlanmış, altın parçacığı hazırlanması yeterli birarada toplanmasını önlemek üzere, kartuş yük çıkışının kolaylaşması için dengelenmelidir. DNA-altın mikro parçacıklar çözelti içinde kalsiyum ve spermidin altın nano DNA moleküllerinin bağlanmasını yardımcı olabilir. Indirgenmiş basınç altında hücrelere nüfuz etme yeteneği nanopartiküller için daha önce 17 tespit edilmiştir. İkinci olarak, gen tabancası doğru açı ve mesafe ile mümkün olduğu kadar sabit bir şekilde monte edilmelidir. Güvenilir bir basınç göstergesi doku bütünlüğünü korumak için, ve uygun amaçlanan hedeflere altın partiküllerin akışını hızlandırmak için, aynı zamanda yeniden üretilebilirlik için gereklidir. Gerçekten de, ekipman mesafe, yönlendirme ve stabilitesi de t için önemli faktörlerdirargeting ve bölgesel seçici teslimat hassasiyet. Bu beyin yapıları çok küçük olduğundan, ateşleme açısı içinde küçük varyasyonları kolayca tüm prosedür daha az güvenilir hale getirebilir. Ve nihayet, hazırlanması ve canlı organotipik dilimleri bakım farklı hayvanlar, beyin bölgelerinde, yaş ve cocultures henüz bol ve güvenilir protokolleri şu anda 2,4,25,26 mevcut on yıllar boyunca zorluklarla dolu edilmiştir. Bu prosedürler kullanıcı optimize biolistik prosedürlere dokuları göndermeden önce olmalıdır. Bu hali hazırda daha tarafsız bir biyolistik parçacıkların darbe etkisine ve kendi kültürler üzerinde heterolog gen etkisini tespit etmek için kullanıcıya izin verecektir. Bu amaçla, EYFP ve EGFP gibi floresan genlerin kullanımının, hassas hedef test etmek ve de zaman 13 arasında bir süreç boyunca, heterolog gen ekspresyonu sureti ile hücresel viabileteyi takip eden yeni bir kullanıcı izin tutulabilir. Için güvenilir kritik adımların birçoğuve bu protokolün tekrarlanabilir kullanımı şu üç paragrafta vurgulanır.
Etkili transfeksiyon için, DNA konsantrasyonu, uygun olmalıdır. Çok yüksek konsantrasyonlar, nanopartiküllerin kümelenmesine neden olurken, çok düşük konsantrasyonları, transfeksiyon verimi engel olur. Altın Büyüklükleri dramatik, transfeksiyon verimini düşürür düzensiz dağılımları neden ve artan sitotoksisite ve oksidatif strese yol açabilir olabilir. Spermidin çözeltinin bitiminden (her 2-3 ayda bir değiştirilmelidir) bağlı olarak kaplama randıman problemleri ile muhtemeldir. Yeterli bir biyolistik yayılması için, etiketleme hatta olmalıdır. Altın nanopartikül / DNA süspansiyonu, homojen olmayan bir etiketleme PVP çözeltisi ile bağlı olabilir. Aynı zamanda, her 2-3 ayda bir değiştirilmelidir. Altın nanopartiküllerinin yüksek bir kaplama MW bandı 27 gibi agaroz jel elektroforezi ile görülebilir.
Her biyolojik sistsoruşturma altında em yanı sıra nakil ve biolistik yayılması optimize seviyelere ulaşmak için gaz basıncında küçük değişiklikler yapılması gerekebilir kullanılan her farklı enstrüman. Önemli bir parametre plastik kartuştan mikro veya nano taşıyıcılar şerit ve doku içine itmek için gerekli olan helyum darbenin basınçtır. Bu hedef üzerinde şok dalgaları oluşturmak ve bozacak ya da matris 17'den dokuyu ayırmak çünkü yüksek gaz basıncı, hücre yaşamını etkileyecektir. Gen tabancası namlusunu hedefleyen ve tamamen dikey dokuya cihazlarına sahip doğru biyolistik dağıtım için önemlidir. Seçilen alan dış açıklığından tam 10 mm haznenin doğrudan merkezi yerleştirilmelidir. Bu üssü çevresinde altın parçacığı, bir teslimat 3 mm çapında sonuçlanır. Gen silah namlusu her kullanımdan sonra% 70 etanol ile temizlenmelidir. , Büyük bir tanecik agregadan dokuyu korumak için, namlu ayrıca gösterilmemiş bir naylon örgü içerenoptimum performans sağlamak için düzenli olarak değiştirilmelidir lirtilmelidir. Değiştirmek için örgü kapağı, kapağın ve O-halkası arasında yeni bir naylon ağ eklemek çıkarın.
2 gün merkez üssü etrafında transfeksiyonundan sonra – floresan ile işaretlenmiş hücreler en az 1 görünür olmalıdır. Yokluğu veya etiketleme hiza gen tabancası montaj yetersiz hazırlanması ve istikrarsızlık neden olabilir. Konfokal mikroskopi kullanılarak hücrelerin gözlemler bir dizi faktöre bağlıdır: uyarma / emisyon ışığın dalga boyuna, iğne deliği boyutunu, objektif lens NA ışık yolu bileşenlerin kırılma indisi, doku ve hizalanma derinliği alet. Bu faktörler, inceleme altındaki her sistem için optimize edilmelidir.
Biyolistikler son gelişmeler bu yöntemin başarısı için istismar edildi. Bu çalışmada kullanılan gen silah namlusu gerekli kuvveti azaltmak ve biyolistik huni amacıyla değiştirilmişBir daha kısıtlı ve belirli bir alanda 17,19 içine dağılım paterni. Diğer varil modifikasyonlar biolistik yayılmasını kısıtlamak ve çıkış basıncını 28 azaltmaya çalıştık ama Dr O'Brien tarafından tasarlanan bu özel olarak tasarlanmış gen tabancası varil standart Helios Gen tabancası takılan tek bir bileşenidir. Daha sonra, alt-mikrometre altın parçacıkları hücresel hasar ve sonuç olarak, devam eden heterolog gen ifadesinin kaybına yol daha önce belirlenmiş olan mikrometre partiküllerinin invazivliğini azaltmak için kullanılmıştır. Biyolistik prosedüre Bu değişiklikler yöntemi 13 genel fizibilite ve tekrarlanabilirlik geliştirmiştir. Böyle Organotipik beyin dilim hazırlık derinlemesine dilimleme işlemi giderilebilir, beyin korumak için bir DMEM-Agaroz matrisi kullanılarak, ve sayısız diğer yararlı gelişmeler olarak dilim hazırlanması ile ilgili diğer gelişmeler daha önce 13 yetişkin dilim kullanımı keşfetmek için etkin bildirdi olgun geliştirdiksinaptik ağlar.
Çalışmamızda esas transfeksiyon verimliliği üzerinde okuma ve görüntü için bir yeteneği fare beyin dokularında nöronların morfolojik özellikleri gibi hücre morfolojisi görselleştirmek için boyalar ve floresan heterolog genleri kullanılmaktadır. Tanımlanmış bir yarıçap içinde stokastik teslimat gürültü oranı sinyal tamamen yerli bağlamında tek bir hücrenin dendritik limanı izole sağladı. Sayısız çabalar, bu morfolojik özelliklerini incelemek için kullanılan gibi, haritalama 'connectomics' veya çeşitli analizler için tek hücreleri etiketlemek için, bu yöntem kolay gibi elektrofizyoloji ve nörit ölçümleri 29,30 gibi mevcut protokolleri ile kombine edilebilir. Şurası açıktır ki, floresan heterolog genlerin kombinasyonları floresan proteinleri stokastik dağılımı olarak tek hücrelerden oluşan bir çok daha sağlam çizilmesine olanak verebilir ve bunların kombinasyonu, tek tek hücrelerin 31,32 rengini belirleyecek. Bu synapsin ve heterolog genin ekson üst akışında glial fibriler asit proteini olarak hücre özel hızlandırıcıların kullanılması da alt popülasyonlarının 33 için ifadeyi kısıtlayabilir. Gerçekten de, genetik materyalin sonsuz çeşitleri, aynı zamanda, bu aynı prosedür kullanılarak altın nanopartiküllerinin bir bölge seçici bir şekilde teslim edilebilir. Toplam Transfekte bölgeler böylece geleneksel yöntemlerle, örneğin diseksiyon gibi ve heterolog genin lokalize etkisini analiz etmek için batı imünoblotlama bu bölgeyi sunulması ile analiz edilebilir.
Organotipik dilim prosedürlerinde iyileştirmeler de daha geniş, uzun vadeli denemeler için beyin dokularının kullanımının yanı izni gibi diğer dokularda ve cocultures kullanımına izin verecektir ve transfeksiyon prosedürleri kolaylaştıracaktır. Lipid ve polimer transfeksiyon önce 34 ve sık sık te geçiştirilmesi için çok düşük verim göstermek membran homeostazını, içselleştirilmesi, protein geçirgenliğini etkilediği bildirilmiştirrminally nöronlar farklılaşmış. Hücre spesifik yük hedeflendirme interne için gerekli olan hücre yüzey reseptörlerini ifade eden hücrelere de uygundur ve bu yöntem son derece seçici olmasına rağmen, bu nokta seçilerek 35 hedef yoksundur olabilir. Viral vektörler, aksi takdirde, üretmek çoğu zaman zor ve maliyetlidir sıkı düzenlemeler gerektiren ve vesileyle sahip güvenlik kaygıları gösterdi. Biyolistik teslim böylece bölge seçici uygun bir doku içindeki nöronlar ve diğer hücre tiplerinin transfeksiyonu için eşsiz bir yeteneği vardır. Altın gibi non biyolistikler kullanımında toksik başkaca Hastaların böyle bir transdermal ilaç teslimat, invaziv olmayan in vivo gen teslim, hem de viral olmayan gen terapileri lokalize olarak Biyomedikal kullanım için zemin hazırlayabilir.
The authors have nothing to disclose.
Yazarlar takviyeli gen ile silah namlusunun üretimi için MRC-lmb atölye teşekkür ederim. Biz de ekipman ve kaynakların kullanımı için Toronto Üniversitesi'nden Dr David R. Hampson teşekkür etmek istiyorum.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Helios gene gun system | Bio Rad | 165-2431 | Gene gun and tube prep station |
HEPES | Sigma | 83264-100ML-F | |
NaCl | Sigma | S7653-250G | |
KCl | Sigma | P9333-500G | |
Na2HPO4 | Sigma | S7907-100G | |
KH2PO4 | Sigma | P9791-100G | |
0.2 µm sterile filter unit | Millipore | SCGPU05RE | to filter media |
DMEM | Gibco | 21885-025 | |
Fetal calf serum | Gibco | 10270-098 | |
D-Glucose | Sigma | G8270-100G | |
N2 | Life Technologies | 17502-048 | |
Penicillin/Streptomycin | Sigma | p4333 | |
Polyvinylpyrrolidone | Sigma | 856568-100G | |
Ethanol | Sigma | 277649-100ML | |
Spermidine | Sigma | S2626 | |
Agarose | Bio Rad | 161-3100EDU | |
Vibroslicer | Laica | VT1200 | We used a custom design |
Gene gun mount | Built in house at U of T | ||
Humidified cell culture incubator | |||
Gold nanoparticles | cytodiagnostics | G-40-20 | |
pEYFP-N1 | Clontech | ||
Tubing cutter | Bio Rad | 165-2422 | |
Tefzel tubing | Bio Rad | 165-2441 | |
Barrel | Custom made by the LMB | ||
Cell culture insert | Millipore | PICM0RG50 | |
Paraformaldehyde | Sigma | 76240 Fluka | |
Dissecting microscope | for convenience | ||
Confocal microscope | user defined for usage | ||
Glass slide | VWR | 2588-CA48323-185 | |
Microcover glass | VWR | 2448-CA48366-067-1 | |
Vectashield mounting media | Vector laboratories | H-1400 |