Gene targeting methodologies can be used to generate transgenic mice with knockout, knock-in and tagged alleles. Here, we describe an improved method of recombineering in E. coli, that we term ‘subcloning plus insertion’, which can be used to generate custom gene targeting vectors rapidly.
Gene targeting refers to the precise modification of a genetic locus using homologous recombination. The generation of novel cell lines and transgenic mouse models using this method necessitates the construction of a ‘targeting’ vector, which contains homologous DNA sequences to the target gene, and has for many years been a limiting step in the process. Vector construction can be performed in vivo in Escherichia coli cells using homologous recombination mediated by phage recombinases using a technique termed recombineering. Recombineering is the preferred technique to subclone the long homology sequences (>4kb) and various targeting elements including selection markers that are required to mediate efficient allelic exchange between a targeting vector and its cognate genomic locus. Typical recombineering protocols follow an iterative scheme of step-wise integration of the targeting elements and require intermediate purification and transformation steps. Here, we present a novel recombineering methodology of vector assembly using a multiplex approach. Plasmid gap repair is performed by the simultaneous capture of genomic sequence from mouse Bacterial Artificial Chromosome libraries and the insertion of dual bacterial and mammalian selection markers. This subcloning plus insertion method is highly efficient and yields a majority of correct recombinants. We present data for the construction of different types of conditional gene knockout, or knock-in, vectors and BAC reporter vectors that have been constructed using this method. SPI vector construction greatly extends the repertoire of the recombineering toolbox and provides a simple, rapid and cost-effective method of constructing these highly complex vectors.
基因打靶技术的发展已使细胞系和小鼠模型的结构,研究了不同的生物系统1-3。在一个基因组序列的修饰的关键第一阶段是靶向载体4的基因的设计和施工。靶向载体质粒构建携带感兴趣含有选择标记( 例如,新霉素 )两侧所需的修改(多个)的等位基因,和在哺乳动物细胞中5需要有效的同源重组长的基因组区域。精确的基因修饰被引入靶向载体导入胚胎干细胞(ES细胞)或6的体细胞7,实现由此在靶载体和DNA序列的相同的延伸之间的同源重组的基因组基因座的结果在期望的修饰的转移通过基因转变8的基因组中。这种modifi编ES细胞可以被注射入小鼠胚泡以产生后代(嵌合体),那么,可以通过与种系9发送这些改性等位基因。备用路由,以产生转基因小鼠包含一个基因表达载体导入单细胞小鼠受精卵,这导致了随机整合在小鼠基因组10中的载体的显微注射。传统载体构建的方法已依赖于常规“剪切和粘贴”使用限制性内切酶和DNA连接酶来克隆不同选择标记和基因组片段插入载体主干克隆。然而,传统的克隆的固有的限制因素是定位和选择限制性位点,尤其是具有较长的DNA序列。这通常需要多个亚克隆步骤,还引入了外源DNA序列插入载体,这往往会导致基因的较低效率定位。
重组工程(重组的ENGineering)是一种DNA工程技术,通过使用由在大肠杆菌噬菌体的重组蛋白介导的同源重组(HR)克服了这些限制大肠杆菌细胞11,12。因为同源序列的任何区域可作为重组工程的基板中,限制位点的可用性的限制被去除。大的DNA序列可以被无缝地在体内直接修改,因此也保持它们的结构完整性13。重组工程是非常有效的短同源性(50碱基对)14,因此,同源臂(HA)可以方便地合并到合成寡序列。在一个典型的重组工程实验,寡或含HA的双链DNA(dsDNA)的片段被电穿孔入重组工程感受态E.的大肠杆菌细胞含有位于无论是在染色体或在质粒上15的靶。重组电位由红REC的诱导型表达赋予ombination蛋白质噬菌体16,17的或外消旋噬菌体18的RecET蛋白质。红/外切酶的RecE线性双链DNA转化到单链DNA(ssDNA)的中间,然后由它的伙伴,红/ RECT,单链退火蛋白(SSAP)19的约束。长的ssDNA或短寡与其互补靶序列退火发生在复制叉的后随链,并导致在靶位点的序列的掺入。随链的ssDNA重组是重组工程的高效率的基础上,并可以由“测试”重组模型20,21进行说明。
一个典型的重组工程的工作流程,以建立一个基因靶向载体包括以下两种路线。一个途径涉及亚克隆从小鼠BAC克隆所需基因组区到质粒随后顺序插入的loxP重组位点,选择标记<s向上> 22等,或替代的路线涉及靶向的BAC基因组基因座与由多轮重组工程10,23,然后亚克隆改性轨迹到质粒通过缺口修复克隆24,25的不同目标矢量元素。有关这一主题的变化已被用于在不同的高通量重组工程管道作为大小鼠生产方案26,27的一部分。然而,这些程序涉及复杂和冗长的阶段,需要使用专门的载体和大肠杆菌大肠杆菌菌株( 例如,Cre表达的细胞),并利用一个或多个中间步骤载体DNA纯化和再转化( 表1)。亚克隆插入加(SPI),是一种将β重组和缺口修复克隆到一个单一的过程( 图1)的新型重组工程技术。 SPI向量组装简单,快捷,灵活,并提供标准recombi显著改善neering接近( 表1)。在这里,我们展示了易用性和使用SPI与特别强调构建非标准和具有挑战性的矢量设计不同载体构建的应用程序。试验例包括荧光报道敲入载体的结构中,双标记的蛋白表达敲入载体,BAC荧光报道载体和条件性敲除载体。这些研究各种要求本地化的细胞表面受体,纯化核蛋白质复合体或有条件地烧蚀的基因的表达。
胚胎干细胞系和小鼠模型建设历来参与基因使用包含修改后的等位基因4质粒构建目标。然而,这些复杂的基因打靶载体的结构已被证明是在及时制作这种模型的一个显著瓶颈。基于重组工程载体的构建发展战略,使得改进的矢量设计和更有效的载体组装。尽管如此,目前的重组工程的协议仍然涉及多个步骤,需要中间质粒纯化,并使用不同的菌株。亚克隆加上插入提供了一个新途径,可以在一个电活动在驻地BAC宿主菌进行载体构建。 SPI的基因打靶的效用此处进行试验的各种载体的构建的应用程序。在这里检测的所有实例中,SPI被证明是有效的和正确的重组质粒制备。在大多数的情况下,多个不同的盒被正确插入在目标载体。大DNA盒和载体中容易地容纳在SPI协议和显示了该系统的灵活性。
SPI依靠使用长的同源序列和硫代磷酸酯(PTO)保护的线性DNA盒的。 PTO修饰赋予保护,防止核酸外切酶的线性DNA 20,21和长的HA增加复合效率,以允许多路复用。然而,合成的长寡聚序列增加累积误差特别缺失的可能性。如果它们包括蛋白编码区的寡核苷酸突变可能是特别有害的。通过HA DNA测序和覆盖所述插盒的全长强烈建议,以消除任何序列改变的克隆。采用高保真DNA聚合酶系统还建议,以避免引进的ŸPCR错误。亚克隆质粒的HA的长度和组合物是更关键的相对于所述插入磁带盒的(数据未示出)。对于特别敏感的应用程序,如建设敲入载体,其中外显子区域的任何突变不会容忍的,插入卡带的HA可被缩短(50-120基点),以避免长时间的寡核苷酸相关的问题。插入暗盒,也可以保持不变或双硫化磷酸酯化(其中,复制方向的知识是不可用)。但复用在这些情况下,仍需要很长的保护HA亚克隆质粒。这个特殊的战略的一个需要注意的是复用效率,可以潜在地影响SPI克隆在不同位点的降低。
插入盒和亚克隆质粒的长度是在SPI克隆的另一个重要参数。较大的DNA分子的电穿孔效率较低,效果是累积的,给定的重quirement引入在同一小区内的所有盒(数据未示出)。复用是最有效的较小插入磁带。 DNA片段大于3 KB也放置限制在Red介导的单链DNA的处理,这是最有效的达到3千30。插入磁带超过3 kb的是双切除,并通过独立的测试通道20重组效率较低。因此,具有足够的菌落,以确定正确的克隆筛选成为在这些情况下,非常重要的。重组后的电持续时间较长也增加了困难SPI练习正确的克隆复苏的机会。多达四个小磁带盒(<1.5 kb的)可以被同时插入与SPI过程中,虽然与每个附加盒的复用效率降低(数据未显示)。然而,这反映了一个最佳的SPI实验的结果,并最好是用许多大型磁带盒时要考虑的多路复用的极限。 </P>
的基因组编辑工具的发展像群集定期相互间隔短回文重复序列(CRISPR)-cas9内切酶系统使建立新的基因组修饰,并导致更高效的基因组工程36。然而,这些新技术已经补充基因靶向载体,而不是取代他们。据设想,该CRISPR-CAS系统可以代替抗生素选择和进一步缩小多路复用重组工程协议。
The authors have nothing to disclose.
T.R.R conceived the project, designed and performed experiments and prepared the manuscript. E.J.K and S.E.M performed experiments. All authors contributed intellectually to the final manuscript. This work was funded by a University of Leicester Innovation Fellowship to SEM and by a UK Medical Research Council (MRC) Senior Research Fellowship to S.M.C (MR/J009202/1). DNA sequencing was performed by Protein and Nucleic Acid Laboratories (PNACL), Centre for Core Biotechnology Services, University of Leicester. We wish to thank A. Francis Stewart for providing the Rox and Dre plasmids. pL451 and pL452 plasmids were obtained from National Cancer Institute (NCI), Frederick, USA.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Antibiotics except Zeocin | Sigma: http://www.sigmaaldrich.com | Ampicillin, A9518-5G; Chloramphenicol , C1919-5G; Blasticidin, 15205-25MG; Gentamicin, G1264-50MG; Hygromycin, H3274-50MG; Kanamycin,: K1876-1G; Tetracycline hydrochloride, T7660-5G; Trimethoprim, 92131-1G |
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Zeocin | Invivogen: | ant-zn-1 | Zeocin is also available from Life technologies/Fisher |
C57BL/6 BAC clones | CHORI: https://bacpac.chori.org/ | RPCI-23 or RPCI-24 BAC libraries | 129/Sv BAC clones can be obtained from Invivogen or Life technologies/Fisher |
KOD hotstart DNA polymerase system | Millipore: https://www.merckmillipore.com | 71086-3 | |
L-Arabinose | Sigma: http://www.sigmaaldrich.com | A3256-25G | |
Long oligos | IDT: https://www.idtdna.com; Gene link: https://www.genelink.com | IDT Ultramers or Gene Link long oligos | PTO and Phosphosphate available as custom modifications. PAGE purification strongly recommended for long oligos. |
MinElute PCR purification kit | Qiagen: http://www.qiagen.com | 28004 | Minimum elution PCR purifications kits are preferred. |
QIAPrep Spin Mini Prep kit | Qiagen: http://www.qiagen.com | 27104 | Silica column or similar matrix kits are preferred. |
Restriction enzymes | NEB: https://www.neb.com | DpnI: R0176L | See NEB website for a list of RE. |