Ratón Trasplante de Riñón: Modelos de rechazo del aloinjerto

Summary

Here, we present a protocol to study the immunology of rejection. The surgical model presented reports a short operating time and a concise technique. Depending on the donor-recipient strain combination, the transplanted kidney may develop acute cellular rejection or chronic allograft damage, defined by interstitial fibrosis and tubular atrophy.

Abstract

Rejection of the transplanted kidney in humans is still a major cause of morbidity and mortality. The mouse model of renal transplantation closely replicates both the technical and pathological processes that occur in human renal transplantation. Although mouse models of allogeneic rejection in organs other than the kidney exist, and are more technically feasible, there is evidence that different organs elicit disparate rejection modes and dynamics, for instance the time course of rejection in cardiac and renal allograft differs significantly in certain strain combinations. This model is an attractive tool for many reasons despite its technical challenges. As inbred mouse strain haplotypes are well characterized it is possible to choose donor and recipient combinations to model acute allograft rejection by transplanting across MHC class I and II loci. Conversely by transplanting between strains with similar haplotypes a chronic process can be elicited were the allograft kidney develops interstitial fibrosis and tubular atrophy. We have modified the surgical technique to reduce operating time and improve ease of surgery, however a learning curve still needs to be overcome in order to faithfully replicate the model. This study will provide key points in the surgical procedure and aid the process of establishing this technique.

Introduction

El trasplante renal con éxito para el tratamiento de la insuficiencia renal fue descrita por primera vez en 1955 entre los gemelos monocigóticos ^1, desde entonces se ha convertido en un revolucionario tratamiento para los pacientes con insuficiencia renal terminal en todo el mundo, ofreciendo mejoras en duración y calidad de vida ^2. Sin embargo la supervivencia del injerto a largo plazo se ha visto obstaculizada por una multitud de procesos patológicos que resultan en daños crónica del injerto ^3.

El rechazo del riñón trasplantado en el ser humano sigue siendo una causa importante de morbilidad, a pesar de las mejoras significativas en los regímenes immunosupporessive. El objetivo de desarrollar un modelo murino de trasplante renal es replicar de cerca el proceso y la patología que se encuentra en el trasplante renal humano ^4. Skoskiewicz et al. Describe primero el modelo murino de trasplante renal en 1973 ^5. Aunque se requieren habilidades de microcirugía avanzados, es una valiosa tool por varias razones: el genoma del ratón ha sido bien caracterizada y hay una gran variedad de métodos y técnicas disponibles para los estudios del ratón experimentales.

Muchos grupos utilizando el modelo de ratón de trasplante renal han utilizado el riñón trasplantado como un órgano que sustenta la vida, sin embargo, en otros estudios y en nuestra metodología descrita uno de los riñones naturales del ratón receptor se deja in situ durante la duración del experimento ^4. El beneficio es que el ratón se somete a una única operación de la anestesia y reduciendo así la morbilidad para el ratón y el riesgo de muerte a partir de un segundo procedimiento. Además, el ratón no sufren de los efectos adversos de la insuficiencia renal progresiva.

Aunque existen modelos de rechazo alogénico en otros órganos tales como el corazón y la piel, estos no siempre son directamente relevantes para el trasplante renal. Hay evidencia de que estos modelos provocan diferentes modos y dymica de rechazo, por ejemplo, el curso de tiempo de rechazo de aloinjerto cardíaco y en aloinjerto renal difiere significativamente en ciertas combinaciones de deformación ^6. Hemos descrito patrones de rechazo de aloinjerto renal aguda en donantes BALB / c en ratones FVB / NJ no transgénicos, este modelo mostró la lesión mediada celular con acumulación de células T y macrófagos ^7. Alternativamente también hemos descrito un modelo de daño crónico del aloinjerto que exhibe la fibrosis intersticial y atrofia tubular, esto resulta de trasplante de un riñón de ratones C57BL / 6 ^BM12 donantes C57BL / 6 en los destinatarios, ya que estos ratones se caracterizan por una sola MIS loci MHC de clase II -match ^8.

Múltiples aspectos del trasplante han sido estudiados utilizando el modelo murino de trasplante renal, incluyendo rechazo agudo, rechazo celular y humoral, lesión de reperfusión de isquemia, y probando nuevos agentes terapéuticos. Hemos modificado el t quirúrgicaechnique para reducir el tiempo de operación y mejorar la facilidad de la cirugía. Particularmente hemos descrito donante simultánea y preparación de receptor y una técnica de anastomosis vascular simplificada mediante la utilización de una anastomosis aórtica parche continuo. Este video y manuscrito proporcionarán puntos clave para ayudar en el establecimiento de esta técnica.

Protocol

Ética institucionales nacionales y locales apropiados deben estar en su lugar antes de realizar los experimentos con animales. Específicamente en el Reino Unido se llevaron a cabo los siguientes experimentos bajo los Animales (Procedimientos Científicos) de la Ley de 1986 Cuando dos microcirujanos están disponibles para funcionar a la vez que el cirujano donante debe realizar los pasos 1.1 a 1.16 luego 3.1 a 3.5, mientras que el cirujano realiza receptor 2.1 a 2.8 . Para un solo operador los pasos pueden ser seguido…

Representative Results

Rechazo de aloinjerto renal puede ser evaluada por análisis histológico de parafina embebido en secciones de tejido fijadas con methacarn del riñón trasplantado (Figura 2). El trasplante de riñones entre isoinjerto resultados ratones singénicos en la lesión por reperfusión isquémica renal, sin embargo por 4 semanas, los túbulos se han recuperado y son histológicamente comparables a los riñones nativos. El rechazo agudo puede ser modelado por C57BL / 6 trasplante de riñón en receptores BALB…

Discussion

La manera más bien descrito para realizar la anastomosis arterial es utilizar la aorta distal del donante, con la arteria renal en la continuación, de una manera de extremo a lado a la aorta destinatario. Se describe el uso de un parche de aorta, similar a la creación de reflejo 'Carrell parche' que lleva a cabo en el trasplante de riñón humano que creemos que es más conveniente. Aunque los informes en la literatura de donante y receptor operativo de tiempo son escasos creemos que la utilización de un par…

Materials

			Surgical Instruments
Blunt Dissecting Scissors	Fine Science Tools	14072-10	For skin cutting
Curved Castoviejo scissors	Fine Science Tools	15017-10	For tissue cutting
Spring Scissors – straight	Fine Science Tools	15000-08	For suture cutting
Toothed forceps 1×2 teeth	Fine Science Tools	11021-12
2 x Fine Tip forceps (Dumont No.5)	Fine Science Tools	11251-20
Angled Fine Tip forceps (Dumont No. 5/45)	Fine Science Tools	11253-25	For blunt dissecting
Curved Fine Tip forcep (Dumont No.7)	Fine Science Tools	11273-22	Useful to pass around vessels
Curved Crile Haemostat	Fine Science Tools	1300-04
Micro clip applicator with lock	Fine Science Tools	18056-14
2 x Micro serrefines spring width 2mm, jaw length 4mm	Fine Science Tools	18055-04	Microvascular clamps
2 x Colibri 3cm wire retractor	Fine Science Tools	17000-03
Castroviejo needle holder with lock	Fine Science Tools	120660-01
Wound clip applicator	Fine Science Tools	12031-07
7mm wound clips	Fine Science Tools	12032-07	Remove 7 to 10 days after surgery
			Equipment
OPMI pico microscope	Carl Zeiss	S100
Thermal cautery unit with fine tip	Geiger	150A
Heat electronic pad	Cozee Cumfort	n/a
Euroklav 23-S	Melag	n/a	Autoclave
			Disposable equipment
7/O Silk braided suture	Pearsall	30514
10/O Dafilon (polyamide) suture	B-Braun	G1118099
6/O Vicryl (plygalectin)	Ethicon	W9537
Regular bevel needle, 1 inch, 21G	Bection, Dickinson and Company	305175	For ureteric anastamosis
Regular bevel needle, 5/8 inch, 25G	Bection, Dickinson and Company	305122
Regular bevel needle, 1/2 inch, 30G	Bection, Dickinson and Company	304000
Insulin needle 1ml, 29G	Bection, Dickinson and Company	324827
Insulin needle 0.3ml, 30G	Bection, Dickinson and Company	324826
1 ml syringe slip tip	Bection, Dickinson and Company	300184
5 ml syringe slip tip	Bection, Dickinson and Company	302187
Wypall paper swabs	Kimberley-Clark	L40	sterilised by autoclave
Cotton wool buds	Johnson and Johnson	n/a	sterilised by autoclave
Plain drapes	Guardian	CB03	sterilised by autoclave
Cell culture dish 60mm x 15mm	Corning Incorporated	430166
Dispensing Pin	B-Braun	DP3500L / 413501	Used with NaCl 0.9%
Re-agents and Drugs
(Lacri-Lube) White soft paraffin 57.3%, mineral oil 42.5% and lanolin alcohols 0.2%	Allergan Ltd	21956GB10X
(Videne) Povidone-iodine 10%	Ecolab Ltd	PL 04509/0041
(Vetalar V) Ketamine hydrochloride	Pfizer Animal Health	Vm 42058/4165	100mg/ml solution (dose 200mg/kg)
(Domitor) Medetomidine hydrochloride	Orion Pharma	Vm 06043/4003	1mg/ml (dose 0.5mg/kg)
(Vetergesic) Bupernorphine hydrochloride	Alsto Animal Health	Vm 00063/4002	0.3mg/ml (dose 0.05mg/kg)
(Antisedan) Atipamezole hydrochoride	Orion Pharma	Vm 06043/4004	5mg/ml (dose 2mg/kg)
University of Wisconsin Solution	Belzer Bridge to Life	n/a	dose approximately 500 microlitres/mouse
NaCl 0.9%	Baxter	FKE1323
Heparin Sulphate	non-proprietary	n/a	5000units/ml (dose 5units/mouse)