القوة الذرية الميكروسكوب من الضوء الأحمر الخلايا المستقبلة عن طريق رسم الخرائط PeakForce الكمية النانوميكانيكية الملكية
Summary
A method for investigating the structure of a protein photoreceptor using atomic force microscopy (AFM) is described in this paper. PeakForce Quantitative Nanomechanical Property Mapping (PF-QNM) reveals intact protein dimers on a mica surface.
Abstract
مجهر القوة الذرية (AFM) يستخدم تلميح هرمي تعلق على ناتئ للتحقيق في استجابة قوة من السطح. والانحرافات من طرف يمكن قياسها إلى ~ 10 السندات الإذنية بواسطة الليزر وكاشف قطاعية، والتي يمكن تحويلها إلى صورة طبوغرافية. تعديل السعة أو "واسطة التنصت" AFM يتضمن التحقيق إجراء اتصالات متقطعة مع السطح بينما تتأرجح في ترددها الرنانة لإنتاج صورة. تستخدم جنبا إلى جنب مع خلية السوائل، والتنصت على وضع AFM تمكن من التصوير من الجزيئات البيولوجية مثل البروتينات في ظروف ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية. يتطلب التنصت AFM ضبط الوضع اليدوي لجنة التحقيق وتعديلات متكررة من العديد من المعلمات المسح التي يمكن تحدي للمستخدمين عديمي الخبرة. للحصول على صور عالية الجودة، وهذه التعديلات هي الأكثر استهلاكا للوقت.
PeakForce الكمية النانوميكانيكية الملكية لرسم الخرائط (PF-QNM) تنتج صورة عن طريق قياس قوة responمنحنى حد ذاتها لكل نقطة اتصال مع العينة. مع برنامج ScanAsyst، PF-QNM يمكن الآلي. هذا البرنامج بضبط مجموعة نقطة، تردد محرك، معدل المسح، المكاسب، وغيرها من المعايير الهامة تلقائيا مسح لعينة معينة. ليس فقط هذه العملية تحمي كلا تحقيقات الهشة والعينات، فإنه يقلل بشكل كبير من الوقت اللازم للحصول على صور عالية الدقة. PF-QNM غير متوافقة لAFM التصوير في السوائل. لذا، فقد التطبيق الواسع النطاق لتصوير المواد ذات الصلة من الناحية البيولوجية.
الطريقة المعروضة في هذه الورقة يصف تطبيق PF-QNM للحصول على صور من مبصرة الضوء الأحمر البكتيرية، RpBphP3 (P3)، من الضوئي R. palustris في دولة تكييفها ضوئها. باستخدام هذه الطريقة، وقد لوحظت dimers البروتين الفردية P3 والركام من dimers على سطح الميكا في وجود مخزن مؤقت التصوير. مع التعديلات المناسبة على السطح و / أو تركيز المحلول، وهذه الطريقةيمكن تطبيقها بشكل عام مع غيرها من الجزيئات ذات الصلة بيولوجيا ومواد لينة.
Introduction
أصبحت قوة المجهر الذري (AFM) أداة مهمة جدا عن التحقيق في الخصائص الهيكلية والميكانيكية للأسطح، الأغشية الرقيقة، والجزيئات واحدة منذ اختراع في عام 1986 (الشكل 1). 1-3 استخدام خلايا السائل، والأسلوب له تصبح مفيدة بشكل خاص في دراسات الجزيئات البيولوجية والخلايا حتى الذين يعيشون في بيئة ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية. 4-10 التنصت على الوضع وقد جرت العادة على استخدامها AFM لتصوير مواد لينة أو جزيئات ملزمة فضفاضة إلى السطح، منذ وضع الاتصال AFM غير مناسب عادة بسبب إلى الأضرار الناجمة عن القوى الجانبية التي مورست على عينة من ناتئ 11 التنصت على وضع AFM يقلل إلى حد كبير من خلال وجود هذه القوات غيض تلمس بشكل متقطع السطح بدلا من أن تكون على اتصال دائم. في هذا الوضع، وتأرجحت ناتئ في أو بالقرب من تردد الرنين العادي إلى السطح. وبالمثل في الاتصال وضع AFM، والطوبوغرافيا هو الشرجyzed من قبل المتهم بالتآمر في حركة ض بيزو بوصفها وظيفة من س ص (المسافة).
يمكن ديناميات ناتئ تكون غير مستقرة تماما في أو بالقرب من صدى. وبالتالي، فهي صعبة للغاية لأتمتة خارج حالة "حالة مستقرة". على وجه التحديد، هذه الديناميات تعتمد على كل من خصائص عينة المسح والبيئة. لجزيء لينة كثف إلى الثابت (إيه) السطح، حلقة ردود الفعل ضبطها جيدا لهذا الجزيء قد يؤدي إلى ردود الفعل التذبذب للسطح. العملية في السائل يزيد من تعقيد ضبط للناتئ. التغيرات في درجة الحرارة أو السوائل مستويات تتطلب التعديل المستمر من نقطة التحديد، المكاسب، والمعلمات التصوير الأخرى. هذه التعديلات تميل إلى أن تكون غاية تستغرق وقتا طويلا وتحديا للمستخدمين.
ذروة القوة الكمي النانوميكانيكية الملكية لرسم الخرائط (PF-QNM)، مثل التنصت وضع AFM، يتجنب التفاعلات الجانبية عن طريق الاتصال متقطع العينة (الشكل 2). 12-15 </ سوب> ومع ذلك، PF-QNM تعمل في وضع غير الرنانة وترددات أقل بكثير من التنصت وضع فؤاد. هذا يلغي التحديات من ضبط التنصت وضع AFM، ولا سيما تلك التي تفاقمت بسبب وجود السائل. مع PF-QNM، يتم جمع الصور من خلال اتخاذ منحنى استجابة القوة في كل نقطة اتصال. مع إضافة برامج ScanAsyst، 15 تعديل المعلمات المسح يمكن الآلي وصورة عالية الدقة الحصول في غضون دقائق من قبل المستخدمين حتى عديم الخبرة. بمجرد أن يصبح المستخدم أكثر دراية AFM، أي من المعلمات الآلي أو كل قد يتم تعطيل في أي وقت الذي يسمح التجريبي لضبط جودة الصورة يدويا. منذ نشأتها، وقد طبقت PF-QNM إلى الخريطة رودوبسين جرثومي، وهو بروتين الغشاء، والبروتينات الأصلية الأخرى على مستوى submolecular 16-18 لرودوبسين جرثومي، هناك علاقة مباشرة بين المرونة البروتين والأشعة السينية هياكل البلورات 12 PF -QNوقد استخدمت M للتحقيق في الخلايا الحية مع ارتفاع القرار. 19،20 الروابط المهمة علاوة على ذلك، أوضحت البيانات PF-QNM بين هيكل والميكانيكا داخل غشاء كرات الدم الحمراء التي تعتبر بالغة الأهمية لسلامة الخلية وظيفة 21
لقد استخدمنا المسح المجهري التحقيق (SPM) الأساليب، بما في ذلك AFM 22، 23 إلى دراسة بنية المستقبلات الضوئية الحمراء ضوء يسمى bacteriophytochromes (BphPs). 24،25 فهي تتألف من وحدة الاستشعار الخفيفة مرتبطة تساهميا إلى وحدة نمطية إشارات-المستجيب هذه كما كيناز الحامض الاميني (هونج كونج) 26 وحدة استشعار للضوء يحتوي عادة على حامل اللون بلعين التي يخضع التحول الهيكلي على امتصاص الفوتون، مع سلسلة من التغييرات الهيكلية الوصول إلى وحدة إشارات-المستجيب ويؤدي إلى التحول العالمي من البروتين بأكمله . 24،27-29 بناء على هذا التحول، وهناك نوعان ضوء متميزة استيعاب قتيتس من BphPs، ضوء استيعاب الدولة الحمراء وتحت الحمراء بعيدة، كما تدل العلاقات العامة وPFR. العلاقات العامة مستقرة حراريا الدولة، وتكييفها داكنة لمعظم BphPs 28 لم يتم فهم الأساس الجزيئي من العلاقات العامة / PFR photoconversion تماما بسبب المعرفة الهيكلية محدودة من هذه البروتينات. باستثناء مبنى واحد من D. radiodurans، 30 جميع الهياكل البلورات نشرت الأشعة السينية من هذه البروتينات في الدولة تتكيف الداكنة وتفتقر نطاق المستجيب. وBphPs سليمة تكون كبيرة جدا لدراستها بشكل فعال بواسطة الرنين المغناطيسي النووي (NMR) ويصعب المعروف أن تتبلور في شكلها سليمة (وخاصة في ولاية تكييفها ضوئية) لالبلورات بالأشعة السينية. وقد تم مؤخرا المهندسة BphPs كعلامات بروتين فلوري تحت الحمراء (IFP ل) 31 التوصيف الهيكلي من هذه البروتينات يمكن أن المزيد من المساعدات في تصميم إف بي فعال. 32-36
التركيز في هذه المقالة هو تقديم إجراءات لتصوير BphPs باستخدام AFM خلايا السائل عبر PF-QNM. وأظهرت دراسات الأسلوب الدولة تكييفها الخفيفة للRpBphP3 bacteriophytochrome (P3) من بكتيريا التمثيل الضوئي R. palustris. الإجراء AFM المقدمة هنا هو نهج مناسب ومباشر للتصوير من البروتينات وكذلك الجزيئات البيولوجية الأخرى. مع هذا الأسلوب، التفاصيل الهيكلية للجزيئات الفردية يمكن جمعها في فترة قصيرة من الزمن، على غرار جلسة مختبر مادة العلوم على مستوى العلوي. من خلال قياس عبر الأقسام واستكمال إجراء المزيد من التحليلات الأبعاد، البيانات التجريبية يمكن مقارنة النماذج الحسابية مفيدة. 37-42
Protocol
Representative Results
Discussion
AFM هو طريقة المسح المجهري التحقيق قادرة تماما على التصوير البروتينات والجزيئات البيولوجية الأخرى في ظروف ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية. بالمقارنة مع البلورات بالأشعة السينية والرنين المغناطيسي النووي والحد من AFM واحد هو عدم قدرتها على تحقيق نفس القرار، ولا سيما …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
واعترف لتمويل شراء الالكترونيات جديدة تحكم، والبرمجيات، وخلايا السائل، وغيرها من المعدات اللازمة لتجميع AFM المزدوج / STM: برنامج NSF-MRI (1229103 CHE). نعترف المرافق المشتركة في جامعة شيكاغو برنامج NSF-MRSEC (DMR-0820054) للحصول على المساعدة مع AFM الأجهزة، والتدريب، والتصوير، والوقت أداة التي أتاحتها شبكة المرافق أبحاث المواد (DMR-0820054). نشكر بشكل خاص الدكتور Qiti قوه، والدكتور جوستين Jureller، والأستاذ كا يي لي لاستقبال طلابنا قبل تمويل الاقتراح NSF-MRI التي جلبت الأجهزة الضروري الحرم الجامعي. ونحن نعترف تمويل من الباب الثالث منحة STEM (ID: P031C110157) منحت لجامعة نورث إيسترن إلينوي التي تقدم رواتب الأبحاث الصيف للطلاب وأعضاء هيئة التدريس وكذلك دعم الإمدادات من المواد الاستهلاكية. وأخيرا، فإننا نعترف بروكر نانو، وشركة لاستمرار دعم دور فعال وللحصول على إذن لصeproduce مؤامرة تبين آلية PeakForce QNM واستخدام ScanAsyst كلمة لوصف البرنامج الآلي.
Materials
| Name of Material/Equipment | Company | Catalog # | Comments |
| Tris-HCl | Fisher Scientific | O4997-100 | |
| NaCl | Acros Organics | 7647-14-5 | |
| MgCl2 | Acros Organics | 7791-18-6 | |
| Multimode 8 AFM | Bruker-Nano | 492-008-011 | equipped with Nanoscope V controller and J scanner |
| Probe | Bruker-Nano | SNL-10, ScanAsyst-Fluid+ | |
| Tapping Mode Fluid Cell | Bruker-Nano | MTFML | |
| Mica V-4 Grade | SPI supplies | 1150503 | 25 x 25 x .26 mm |
| Sample support disk | nanoSurf | BT02236 | |
| Petri dish | Plasta-Medic, Inc. | 100 mm x 15 mm | |
| micropipettors | Denville Scientific | XL 3000i | |
| RpBphP3 | Prepared according to cited references | ||
| Nanoscope software | Bruker-Nano | ||
| Fiber Optic Light | Digital Instruments Inc. | F0-50 | |
| Pelco AFM Disc Gripper | Ted Pella Inc | 1668 | 12 mm |
| 1 ml syringe | McKesson | 102-ST1C | |
| Eppendorf tubes | Denville Scientific | C2171 | |
| The Pymol Molecular Graphic System v.1.5.0.1 | Schrodinger, LLC |
References
- Binnig, G., Quate, C. F., Gerber, C. Atomic Force Microscope. Phys. Rev. Lett. 56, 930-933 (1986).
- Sonnenfeld, R., Hansma, P. K. Atomic-Resolution Microscopy in Water Science. 232, 211-213 (1986).
- Nikiforov, M. P., Darling, S. B. Concurrent Quantitative Conductivity and Mechanical Properties Measurements of Organic Photovoltaic Materials using AFM. J. Vis. Exp. 71, (2013).
- Bahatyrova, S. The Native Architechure of a Photosynthetic Membrane. Nature. 430, 1058-1061 (2004).
- Sturgis, J. N., Tucker, J. D., Olsen, J. D., Hunter, C. N., Niederman, R. A. Atomic Force Microscopy Studies of Native Photosynthetic Membranes. Biochem. 48, 3679-3698 (2009).
- Pelling, A. E., Li, Y., Shi, W., Gimzewski, J. K. Nanoscale visualization and characterization of Myxococcus xanthus cells with atomic force microscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 102, 6484-6489 (2005).
- Viani, M. B. Probing Protein-Protein Interactions in Real-Time. Nature: Structural Biology. 7, 644-648 (2000).
- Hook, F., Kasemo, B., Grunze, M., Zauscher, S. Quantitative Biological Surface Science, Challenges and Recent Advances. ACS Nano. 2, 2428-2436 (2008).
- Thomas, G., Burnham, N. A., Camesano, T. A., Wen, Q. Measuring the Mechanical Properties of Living Cells Using Atomic Force Microscopy. J. Vis. Exp. (76), (2013).
- Murphy, P. J. M., Shannon, M., Goertz, J. Visualization of Recombinant DNA and Protein Complexes Using Atomic Force Microscopy. J. Vis. Exp. (53), (2011).
- Poggi, M. A. Scanning Probe Microscopy. Anal. Chem. 76, 3429-3444 (2004).
- Rico, F., Su, C., Scheuring, S. Mechanical Mapping of Single Membrane Proteins at Submolecular Resolution. Nano Letters. 11, 3983-3986 (2012).
- Foster, B. The State of Microscopy for 2012. Amer. Lab. 43, 4-6 (2011).
- Guzman, H. V., Perrino, A. P., Garcia, R. Peak Forces in High-Resolution Imaging of Soft Matter in Liquid. ACS Nano. 7, 3198-3204 (2013).
- Kaemmer, S. B. Introduction to Bruker’s ScanAsyst and PeakForce Tapping AFM Technology. , (2011).
- Dufrêne, Y. F., Martinez-Martin, D., Medalsy, I., Alsteens, D., Muller, D. J. Multiparametric imaging of biological systems by force-distance curve-based AFM. Nature Methods. 10, 847-854 (2013).
- Pfreundschuh, M., Martinez-Martin, D., Mulvihill, E., Wegmann, S., Muller, D. J. Multiparametric high-resolution imaging of native proteins by force-distance curve–based AFM. Nature Protocols. 9, 1113-1130 (2014).
- Pfreundschuh, M., Alsteens, D., Hilbert, M., Steinmetz, M. O., Muller, D. J. Localizing Chemical Groups while Imaging Single Native Proteins by High-Resolution Atomic Force Microscopy. Nano Letters. 14, 2957-2964 (2014).
- Berquanda, A. Atomic Force Microscopy Imaging of Living Cells. Microscopy Today. 18, 8-14 (2010).
- Heua, C., Berquand, A., Elie-Cailleb, C., Nicoda, L. Glyphosate-induced Stiffening of HaCaT Keratinocytes, a Peak Force Tapping Study on Living Cells. J. Struc. Biol. 178, 1-7 (2012).
- Picas, L., Rico, F., Deforet, M., Scheuring, S. Structural and Mechanical Heterogeneity of the Erythrocyte Membrane Reveals Hallmarks of Membrane Stability. ACS Nano. 7, 1054-1063 (2013).
- Tobias, F. G. Scanning Probe Microscopy of Bacterial Red-Light. Proc. 1465, doi:10.1557/opl.2012.1006. , (2012).
- Sorenson, B. A. Domain Structure of a Unique Bacterial Red Light Photoreceptor as Revealed by Atomic Force Microscopy. Mater. Res. Soc. Symp. Proc. 1652, (2013).
- Rockwell, N. C., Lagarias, J. C. The structure of phytochrome: a picture is worth a thousand spectra. Plant Cell. 18, 4-14 (2006).
- Rockwell, N. C., Shang, L., Martin, S. S., Lagarias, J. C. Distinct classes of red/far-red photochemistry within the phytochrome superfamily. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106, 6123-6127 (2009).
- Noack, S., Michael, N., Rosen, R., Lamparter, T. Protein conformational changes of Agrobacterium phytochrome Agp1 during chromophore assembly and photoconversion. Biochem. 46, 4164-4176 (2007).
- Noack, S., Lamparter, T. Light modulation of histidine-kinase activity in bacterial phytochromes monitored by size exclusion chromatography, crosslinking, and limited proteolysis. Methods of Enzymology. 423, 203-221 (2007).
- Rockwell, N. C., Su, Y. S., Lagarias, J. C. Phytochrome structure and signaling mechanisms. Annual Review Plant Biology. 57, 837-856 (2006).
- Bhoo, S. H., Davis, S. J., Walker, J., Karniol, B., Vierstra, R. D. Bacteriophytochromes Are Photochromic Histidine Kinases Using a Biliverdin Chromophore. Nature. 414, 776-779 (2001).
- Takala, H. Signal amplification and transduction in phytochrome photosensors. Nature. 509, 245-248 (2014).
- Filonov, G. S. Stable Near-Infared Fluorescent Protein for in vivo Imaging. Nature Biotech. 29, 757-761 (2011).
- Samma, A. A., Johnson, C. K., Song, S., Alvarez, S., Zimmer, M. On the Origin of Fluorescence in Bacteriophytochrome Infrared Fluorescent Proteins. J. Phys. Chem. B. 114, 15362-15369 (2011).
- Lehtivuori, H. Fluorescence Properties of the Chromophore-Binding Domain of Bacteriophytochrome from Deinococcus radiodurans. J. Phys. Chem. B. 117, 11049-11057 (2013).
- Toh, K. C. Primary Reactions of Bacteriophytochrome Observed with Ultrafast Mid-Infrared Spectroscopy. J. Phys. Chem. A. 115, 3778-3786 (2011).
- Auldridge, M. E., Satyshur, K. A., Anstrom, D. M., Forest, K. T. Structure-guided engineering enhances a phytochrome-based infrared fluorescent protein. J. Biol. Chem. 287, 7000-7009 (2012).
- Toh, K. C., Stojkovic, E. A., van Stokkum, I. H., Moffat, K., Kennis, J. T. Proton-transfer and hydrogen-bond interactions determine fluorescence quantum yield and photochemical efficiency of bacteriophytochrome. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 107, 9170-9175 (2010).
- . The Pymol Molecular Graphic System v.1.5.0.1. , .
- Yang, X., Stojkovic, E. A., Kuk, J., Crystal Moffat, K. structure of the chromophore binding domain of an unusual bacteriophytochrome, RpBphP3, reveals residues that modulate photoconversion. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104, 12571-12576 (2007).
- Yang, X., Kuk, J., Moffat, K. Crystal structure of Pseudomonas aeruginosa bacteriophytochrome: photoconversion and signal transduction. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105, 14715-14720 (2008).
- Woitowich, N. K., Garrido, C., Ozarowski, W., Stojkovic, E. A. Preliminary X-ray Crystallographic and Structural Analyses of a Bacteriophytochrome from Stigmatella aurantiaca. The FASEB Journal. 25, 928 (2011).
- Wagner, J. R., Zhang, J., Brunzelle, J. S., Vierstra, R. D., Forest, K. T. High resolution structure of Deinococcus bacteriophytochrome yields new insights into phytochrome architecture and evolution. J. Biol. Chem. 282, 12298-12309 (2007).
- Wagner, J. R. Mutational analysis of Deinococcus radiodurans bacteriophytochrome reveals key amino acids necessary for the photochromicity and proton exchange cycle of phytochromes. J. Biol. Chem. 283, 12212-12226 (2008).
