A method for investigating the structure of a protein photoreceptor using atomic force microscopy (AFM) is described in this paper. PeakForce Quantitative Nanomechanical Property Mapping (PF-QNM) reveals intact protein dimers on a mica surface.
Atomkraftsmikroskop (AFM) använder en pyramidal spets fäst vid en konsol för att sondera den kraft svar på en yta. De avböjningar av spetsen kan mätas till ~ 10 pN av en laser och sektoriserat detektor, vilken kan omvandlas till bild topografi. Amplitudmodulering eller "knacka läge" AFM innebär sonden gör intermittent kontakt med ytan medan oscillerande vid sin resonansfrekvens för att producera en bild. Används tillsammans med en vätska cell, knacka-mode AFM möjliggör avbildning av biologiska makromolekyler såsom proteiner i fysiologiskt relevanta förhållanden. Tapping-mode AFM kräver manuell inställning av sonden och täta justeringar av en mängd skanning parametrar som kan utmanande för oerfarna användare. För att få bilder av hög kvalitet, dessa justeringar är de mest tidskrävande.
PeakForce Kvantitativ Nanomechanical Property Mapping (PF-QNM) producerar en bild genom att mäta en kraft response kurva för varje punkt i kontakt med provet. Med ScanAsyst programvara kan PF-QNM automatiseras. Denna programvara justerar börvärdet, drivfrekvens, svephastighet, vinster och andra viktiga inläsningsparametrarna automatiskt för ett givet prov. Inte bara denna process skydda både ömtåliga sonder och prover, avsevärt minskar den tid som krävs för att få högupplösta bilder. PF-QNM är kompatibel för AFM avbildning i vätska; Därför har den omfattande ansökan för avbildning biologiskt relevant material.
Den metod som presenteras i detta dokument beskriver tillämpningen av PF-QNM att få bilder av en bakteriell rödljusljusmätare, RpBphP3 (P3), från foto R. palustris i dess ljus-anpassad tillstånd. Med denna metod har enskilda protein dimerer av P3 och aggregat av dimerer observerats på en glimmer yta i närvaro av en avbildande buffert. Med lämpliga justeringar till ytan och / eller lösningskoncentration, denna metodkan allmänt tillämpas på andra biologiskt relevanta makromolekyler och mjuka material.
Atomic force microscopy (AFM) har blivit ett mycket viktigt verktyg för undersökning av de strukturella och mekaniska egenskaperna hos ytor, tunna filmer, och enstaka molekyler sedan dess uppfinning i 1986 (figur 1). 1-3 Med användning av en flytande-cell, har metoden bli särskilt användbara i studier av biologiska makromolekyler och med levande celler i en fysiologiskt relevant miljö. 4-10 Gäng-mode AFM har traditionellt använts för avbildning av mjuka material eller löst bundna molekyler till ytan, eftersom kontakt-mode AFM är typiskt olämpliga på grund till skador som orsakats av de sidokrafter som utövas på prov av fribärande. 11 Tapping-mode AFM väsentligt minskar dessa krafter genom att ha spetsen intermittent röra ytan snarare än att vara i ständig kontakt. I det här läget är den fribärande oscilleras vid eller nära dess resonansfrekvens normal till ytan. Likaså att kontakta-mode AFM, är topografi analyzed genom plottning rörelsen av z-piezo som en funktion av xy (avstånd).
De fribärande dynamik kan vara ganska instabil vid eller nära resonans; därför är de mycket utmanande att automatisera utanför ett "steady-state" situation. Specifikt denna dynamik är beroende av båda egenskaperna prov och scanning miljö. För en mjuk molekyl adsorberat till en hård (er) yta, kan en väl avstämd återkopplingsslinga för molekylen leda till återkoppling pendling till ytan. Drift i vätskan ytterligare komplicerar tuning av konsolen. Förändringar i temperatur eller vätskenivåer kräver ständig justering av börvärde, vinster och andra bildparametrar. Dessa justeringar tenderar att vara mycket tidskrävande och utmanande för användarna.
Peak Force Kvantitativ Nanomechanical Property Mapping (PF-QNM), som att knacka läge AFM, undviker sido interaktioner med intermittent kontakta provet (Figur 2). 12-15 </ Sup> Men PF-QNM verkar i icke-resonant mode och frekvenser mycket lägre än att knacka-mode AFM. Detta eliminerar avstämnings utmaningar tapping-mode AFM, i synnerhet de som förvärras av närvaron av fluidum. Med PF-QNM är bilderna samlas genom att ta en kraft svarskurva vid varje kontaktpunkt. Med tillägg av ScanAsyst programvara kan 15 justering av inläsningsparametrarna automatiseras och en högupplöst bild som erhållits i några minuter genom att även oerfarna användare. När användaren blir mer bekant med AFM, kan någon eller alla av de automatiserade parametrar avaktiveras när som helst, som medger experimentalist att finjustera bildkvalitet manuellt. Sedan starten har PF-QNM tillämpats för att kart bacteriorhodopsin, ett membranprotein, och andra naturliga proteiner på submolecular nivå. 16-18 För bacteriorhodopsin, det finns ett direkt samband mellan protein flexibilitet och röntgenkristallografiska strukturer. 12 PF -QNM har använts för att undersöka levande celler med hög upplösning. 19,20 Dessutom har PF-QNM uppgifter belysas viktiga samband mellan struktur och mekanik inom erytrocytmembranet som är avgörande för cellernas integritet och funktion. 21
Vi har anställt svepspetsmikroskopi (SPM) metoder, 22 inklusive AFM, 23 för att studera strukturen av röda ljus fotoreceptorer som kallas bacteriophytochromes (BphPs). 24,25 De består av en ljussensormodul kovalent bunden till en signalering-effektor modul sådan som histidin kinas (HK). 26 Ljus avkänning modul innehåller normalt en Bilin kromofor som genomgår strukturomvandling vid absorption av en foton, med en rad strukturella förändringar som når signaler-effektor modul och leder till en global transformation av hela proteinet . 24,27-29 Utifrån denna förvandling, det finns två distinkta ljusabsorberande states av BphPs, en röd och långt rött ljusabsorberande tillstånd betecknas Pr och Pfr. Pr är termiskt stabil, dark-anpassad tillståndet för de flesta BphPs. 28 Den molekylära grunden för Pr / Pfr photoconversion är inte helt förstådd på grund av begränsad strukturell kunskap om dessa proteiner. Med undantag av en struktur från D. radiodurans, 30 alla publicerade röntgenkristallografiska strukturer av dessa proteiner är i mörkret anpassade tillstånd och saknar effektordomän. De intakta BphPs är för stora för att effektivt studeras med kärnmagnetisk resonans (NMR) och är notoriskt svåra att kristallisera i deras intakt form (i synnerhet i ljuset anpassat tillstånd) för röntgenkristallografi. BphPs har nyligen konstruerad som infraröd fluorescerande proteinmarkörer (IFP: s). 31 Strukturell karakterisering av dessa proteiner kan ytterligare stöd i effektiv IFP design. 32-36
Fokus i denna artikel är att presentera ett förfarande föravbildning av BphPs använder flytande-cells AFM via PF-QNM. Metoden demonstreras genom studier av den ljus anpassad topp bacteriophytochrome RpBphP3 (P3) från den fotosyntetiska bakterien R. palustris. Förfarandet AFM presenteras här är bekvämt och okomplicerad metod för avbildning av proteiner och andra biologiska makromolekyler. Med denna metod kan strukturella detaljer i enskilda molekyler samlas i en kort tid, liknande en övre nivå vetenskap kurs laboration. Genom att mäta tvärsnitt och utföra ytterligare dimension analyser, kan experimentella data jämföras användbara beräkningsmodeller. 37-42
AFM är en svepspetsmikroskopi metoden helt kapabel att avbilda proteiner och andra biologiska makromolekyler i fysiologiskt relevanta förhållanden. I jämförelse med röntgenkristallografi och NMR, är en begränsning av AFM dess oförmåga att uppnå samma upplösning, särskilt upplösning sidled. Vid användning av AFM för att analysera en molekyl på alla ytor, måste effekterna av ytan och sonden på bilden av molekylen också beaktas när data analyseras. Deconvoluting av sonden påverkan på det förvärvade…
The authors have nothing to disclose.
NSF-MRI-programmet (CHE: 1.229.103) är känd för att finansiera inköp av nya styrelektronik, programvara, flytande celler och annan utrustning som behövs för att montera en dubbel AFM / STM. Vi erkänner de delade resurser på The University of Chicago NSF-MRSEC programmet (DMR-0.820.054) för hjälp med AFM instrumentering, utbildning och bildhantering, samt för instrumenttiden görs tillgänglig av Materials Research Faciliteter Network (DMR-0.820.054). Vi tackar särskilt Dr Qiti Guo, Dr Justin Jureller, och professor Ka Yee Lee för att välkomna våra elever inför finansieringen av NSF-MRI förslag som förde den nödvändiga instrument till vårt campus. Vi erkänner finansiering från en avdelning III STEM bidrag (ID: P031C110157) delas Northeastern Illinois University som gav sommarforskningsstipendier för studenter och lärare samt stöd för förbrukningsmaterial. Slutligen erkänner vi Bruker-Nano, Inc. för fortsatt instrumentellt stöd och om tillstånd att reproduce en plot som visar mekanismen för PeakForce QNM och att använda ordet ScanAsyst att beskriva automatiserad programvara.
Name of Material/Equipment | Company | Catalog # | Comments |
Tris-HCl | Fisher Scientific | O4997-100 | |
NaCl | Acros Organics | 7647-14-5 | |
MgCl2 | Acros Organics | 7791-18-6 | |
Multimode 8 AFM | Bruker-Nano | 492-008-011 | equipped with Nanoscope V controller and J scanner |
Probe | Bruker-Nano | SNL-10, ScanAsyst-Fluid+ | |
Tapping Mode Fluid Cell | Bruker-Nano | MTFML | |
Mica V-4 Grade | SPI supplies | 1150503 | 25 x 25 x .26 mm |
Sample support disk | nanoSurf | BT02236 | |
Petri dish | Plasta-Medic, Inc. | 100 mm x 15 mm | |
micropipettors | Denville Scientific | XL 3000i | |
RpBphP3 | Prepared according to cited references | ||
Nanoscope software | Bruker-Nano | ||
Fiber Optic Light | Digital Instruments Inc. | F0-50 | |
Pelco AFM Disc Gripper | Ted Pella Inc | 1668 | 12 mm |
1 ml syringe | McKesson | 102-ST1C | |
Eppendorf tubes | Denville Scientific | C2171 | |
The Pymol Molecular Graphic System v.1.5.0.1 | Schrodinger, LLC |