Microscopía de Fuerza Atómica de Red-Light fotorreceptores a través de cartografía PeakForce cuantitativa nanomecánico Propiedad
Summary
A method for investigating the structure of a protein photoreceptor using atomic force microscopy (AFM) is described in this paper. PeakForce Quantitative Nanomechanical Property Mapping (PF-QNM) reveals intact protein dimers on a mica surface.
Abstract
Microscopía de fuerza atómica (AFM) utiliza una punta piramidal unida a un voladizo para investigar la respuesta de la fuerza de una superficie. Las deflexiones de la punta se pueden medir a ~ 10 pN por un láser y un detector sectorizado, que puede ser convertido a la imagen topografía. La modulación de amplitud o AFM "modo de tocar" implica la sonda de toma de contacto intermitente con la superficie mientras oscilante a su frecuencia resonante para producir una imagen. Utilizado conjuntamente con una célula de fluido, de modo tapping AFM permite la obtención de imágenes de macromoléculas biológicas tales como proteínas en condiciones fisiológicamente pertinentes. -Modo de tocar AFM necesita un ajuste manual de la sonda y ajustes frecuentes de una multitud de parámetros de análisis que puede ser un reto para los usuarios sin experiencia. Para obtener imágenes de alta calidad, estos ajustes son los que más tiempo consume.
PeakForce cuantitativa nanomecánico Asignación de propiedades (PF-QNM) produce una imagen mediante la medición de una respon vigorSE curva para cada punto de contacto con la muestra. Con el software ScanAsyst, PF-QNM se puede automatizar. Este software ajusta el punto de ajuste, frecuencia de accionamiento, velocidad de barrido, las ganancias, y otros parámetros importantes de escaneado automáticamente para una muestra dada. No sólo este proceso de proteger ambas sondas frágiles y muestras, se reduce significativamente el tiempo requerido para obtener imágenes de alta resolución. PF-QNM es compatible para el AFM de imágenes en el líquido; por lo tanto, tiene una amplia aplicación para obtener imágenes de materiales biológicamente relevantes.
El método presentado en este trabajo se describe la aplicación de PF-QNM para obtener imágenes de una bacteriana fotorreceptor de luz roja, RpBphP3 (P3), a partir de la fotosíntesis R. palustris en su estado de luz adaptado. Usando este método, los dímeros de proteínas individuales de P3 y agregados de dímeros se han observado en una superficie de mica en presencia de un tampón de formación de imágenes. Con los ajustes apropiados a la superficie y / o concentración de la solución, este métodopuede aplicarse en general a otras macromoléculas biológicamente relevantes y materiales blandos.
Introduction
Microscopía de fuerza atómica (AFM) se ha convertido en una herramienta muy importante para la investigación de las propiedades estructurales y mecánicas de superficies, películas delgadas, y las moléculas individuales desde su invención en 1986 (Figura 1). 1-3 Uso de una célula líquido, el método tiene llegado a ser particularmente útil en los estudios de macromoléculas biológicas y células incluso que viven en un ambiente fisiológicamente relevante. 4-10 Tapping-mode AFM se ha utilizado tradicionalmente para obtener imágenes de materiales blandos o moléculas unidas débilmente a la superficie, ya que el modo de contacto-AFM es típicamente inadecuado debido a los daños causados por las fuerzas laterales ejercidas sobre la muestra por el voladizo. 11 AFM en modo Tapping reduce sustancialmente estas fuerzas por tener la punta toque la superficie de forma intermitente en lugar de estar en contacto constante. En este modo, el voladizo se hace oscilar en o cerca de su frecuencia de resonancia normal a la superficie. Al igual que en contacto con el modo de AFM, la topografía es analyzed trazando el movimiento de la piezo-z como una función de xy (distancia).
La dinámica en voladizo pueden ser bastante inestables a o cerca de resonancia; por lo tanto, son muy difíciles de automatizar fuera de una situación de "estado estacionario". En concreto, estas dinámicas dependen tanto de las propiedades de la muestra y entorno de digitalización. Para una molécula suave adsorbido a un (a) superficie dura, un bucle de retroalimentación bien afinado para la molécula puede dar lugar a la oscilación de realimentación para la superficie. Operación en el líquido complica aún más la sintonización del voladizo. Los cambios en los niveles de temperatura o de fluidos requieren reajuste constante de punto de ajuste, las ganancias, y otros parámetros de imagen. Estos ajustes suelen llevar mucho tiempo muy difícil y para los usuarios.
Pico Quantitative Fuerza nanomecánico Asignación de propiedades (PF-QNM), como tocar el modo de AFM, evita interacciones laterales poniéndose en contacto con la muestra de forma intermitente (Figura 2). 12-15 </ Sup> Sin embargo, PF-QNM opera en modo no-resonante y frecuencias mucho más bajas que en modo tapping AFM. Esto elimina los problemas de ajuste de modo de contacto intermitente-AFM, en particular los exacerbado por la presencia de fluido. Con PF-QNM, las imágenes se recogieron mediante la adopción de una curva de respuesta de la fuerza en cada punto de contacto. Con la adición de software ScanAsyst, 15 de ajuste de los parámetros de análisis puede ser automatizado y una imagen de alta resolución obtuvo en cuestión de minutos, incluso por usuarios inexpertos. Una vez que el usuario se familiarice con el AFM, cualquiera o todos los parámetros automatizados pueden estar desactivadas en cualquier momento que permite la experimentalista para ajustar la calidad de imagen de forma manual. Desde su creación, PF-QNM se ha aplicado para asignar bacteriorodopsina, una proteína de membrana, y otras proteínas nativas a nivel submolecular. 16-18 Para bacteriorodopsina, hay una correlación directa entre la flexibilidad de proteínas y de rayos X las estructuras cristalográficas. 12 PF -qnM se ha utilizado para investigar las células vivas con alta resolución. 19,20 conexiones importantes Además, los datos PF-QNM ha dilucidado entre la estructura y la mecánica dentro de la membrana de los eritrocitos que son críticas para la integridad y función celular. 21
Hemos empleado de microscopía de sonda de barrido (SPM) métodos, incluyendo AFM 22, 23 para estudiar la estructura de los fotorreceptores de luz roja llamada bacteriophytochromes (BphPs). 24,25 Se componen de un módulo de detección de luz unido covalentemente a un módulo de señalización efector tales como histidina quinasa (HK). 26 El módulo de detección de luz normalmente contiene un cromóforo bilin que experimenta la transformación estructural tras la absorción de un fotón, con una serie de cambios estructurales que llegan al módulo de señalización efector y que conducen a una transformación global de la proteína entera . 24,27-29 Sobre la base de esta transformación, hay dos absorción de luz distinta sstados de BphPs, una luz que absorbe estado rojo y rojo lejano, denotan como Pr y Pfr. Pr es térmicamente estable estado, adaptada a la oscuridad para la mayoría de BphPs. 28 La base molecular de Pr / Pfr fotoconversión no se entiende por completo debido al conocimiento estructural limitada de estas proteínas. Con la excepción de una estructura de D. radiodurans, 30 todas las estructuras cristalográficas de rayos X publicada de estas proteínas están en el estado adaptado a la oscuridad y carecen de dominio efector. Los BphPs intactos son demasiado grandes para ser estudiado de manera efectiva por resonancia magnética nuclear (RMN) y son notoriamente difíciles de cristalizar en su forma intacta (particularmente en el estado de luz adaptado) para la cristalografía de rayos X. BphPs Recientemente se han diseñado como marcadores de proteínas fluorescentes infrarrojos (de IFP). 31 Caracterización estructural de estas proteínas puede ayudar aún más en el diseño IFP efectiva. 32-36
El foco de este artículo para presentar un procedimiento paraobtención de imágenes de BphPs utilizando AFM de células de líquido a través de PF-QNM. El método se demuestra por los estudios del estado de luz adaptada de la RpBphP3 bacteriophytochrome (P3) a partir de la bacteria fotosintética R. palustris. El procedimiento que aquí se presenta es AFM enfoque conveniente y sencillo para obtención de imágenes de proteínas, así como otras macromoléculas biológicas. Con este método, los detalles estructurales de moléculas individuales se pueden recoger en un corto período de tiempo, similar a una sesión de laboratorio curso de ciencias de nivel superior. A través de la medición de secciones transversales y completando nuevos análisis dimensionales, los datos experimentales se pueden comparar con los modelos computacionales útiles. 37-42
Protocol
Representative Results
Discussion
AFM es un método de microscopía de sonda de barrido completamente capaz de visualizar las proteínas y otras macromoléculas biológicas en condiciones fisiológicamente pertinentes. En comparación con la cristalografía de rayos X y RMN, una limitación de AFM es su incapacidad para lograr la misma resolución, en particular la resolución lateral. Cuando se utiliza AFM para analizar una molécula en cualquier superficie, el impacto de la superficie y la sonda en la imagen de la molécula también deben ser consider…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
El programa de la NSF-MRI (CHE: 1229103) es reconocido por la financiación de la compra de la nueva electrónica de control, software, líquido de las células, y otros equipos necesarios para montar un doble AFM / STM. Reconocemos las instalaciones compartidas en la Universidad de Chicago programa NSF-MRSEC (DMR-0820054) para obtener ayuda con la instrumentación de AFM, la capacitación y formación de imágenes, y de tiempo de instrumentos puestos a disposición por la Red de Investigación Instalaciones Materiales (DMR-0820054). Particularmente Agradecemos al Dr. Qiti Guo, Dr. Justin Jureller, y el Prof. Ka Yee Lee para dar la bienvenida a nuestros estudiantes antes de la financiación de la propuesta de la NSF-MRI que trajo la instrumentación necesaria para nuestro campus. Reconocemos la financiación de una beca Título III STEM (ID: P031C110157) otorgó a la Universidad Northeastern Illinois que proporciona becas de investigación de verano para estudiantes y profesores, así como el apoyo a los consumibles. Por último, reconocemos Bruker-Nano, Inc. para la continuación del apoyo instrumental y permiso para reproduce un gráfico que muestra el mecanismo de PeakForce QNM y usar la palabra ScanAsyst para describir el software automatizado.
Materials
| Name of Material/Equipment | Company | Catalog # | Comments |
| Tris-HCl | Fisher Scientific | O4997-100 | |
| NaCl | Acros Organics | 7647-14-5 | |
| MgCl2 | Acros Organics | 7791-18-6 | |
| Multimode 8 AFM | Bruker-Nano | 492-008-011 | equipped with Nanoscope V controller and J scanner |
| Probe | Bruker-Nano | SNL-10, ScanAsyst-Fluid+ | |
| Tapping Mode Fluid Cell | Bruker-Nano | MTFML | |
| Mica V-4 Grade | SPI supplies | 1150503 | 25 x 25 x .26 mm |
| Sample support disk | nanoSurf | BT02236 | |
| Petri dish | Plasta-Medic, Inc. | 100 mm x 15 mm | |
| micropipettors | Denville Scientific | XL 3000i | |
| RpBphP3 | Prepared according to cited references | ||
| Nanoscope software | Bruker-Nano | ||
| Fiber Optic Light | Digital Instruments Inc. | F0-50 | |
| Pelco AFM Disc Gripper | Ted Pella Inc | 1668 | 12 mm |
| 1 ml syringe | McKesson | 102-ST1C | |
| Eppendorf tubes | Denville Scientific | C2171 | |
| The Pymol Molecular Graphic System v.1.5.0.1 | Schrodinger, LLC |
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