PeakForce Kantitatif Nanomekanik Gayrimenkul Eşleme Kullanma Kırmızı Işık fotoreseptör Atomik Kuvvet Mikroskobu
Summary
A method for investigating the structure of a protein photoreceptor using atomic force microscopy (AFM) is described in this paper. PeakForce Quantitative Nanomechanical Property Mapping (PF-QNM) reveals intact protein dimers on a mica surface.
Abstract
Atomik kuvvet mikroskopisi (AFM), bir yüzeyin bir güç yanıtı araştırmak için bir konsol bağlı bir piramit şeklinde bir uca kullanır. Ucunun çökme görüntü topografisine dönüştürülebilen bir lazer ve bölümlere ayrılmış detektör tarafından ~ 10 pN ölçülebilir. Genlik modülasyonu veya "dokunarak modu" AFM bir görüntü üretmek için rezonans frekansında titreşen ise yüzeyi ile aralıklı temas probu içerir. Bir sıvı hücre ile birlikte kullanılan, dokunarak modu AFM gibi fizyolojik ilgili koşullarda proteinler gibi biyolojik makromoleküllerin görüntüleme sağlar. Dokunulduğunda mod AFM probu ve deneyimsiz kullanıcılar için zor olabilir tarama parametreleri çok sayıda sık ayarlamaları manuel ayar gerektirir. Yüksek kaliteli görüntüler elde etmek için, bu ayarlamalar çok zaman tüketir.
PeakForce Kantitatif Nanomekanik İşletme Haritalama (PF-QNM) bir kuvvet yanıtlayanların ölçerek bir görüntü oluştururnumune ile temas her noktada için tek başlarına eğrisi. ScanAsyst yazılım ile, PF-QNM otomatik olabilir. Bu yazılım otomatik olarak belirli bir örnek için ayar noktası, sürücü frekansı, tarama hızı, kazanç, ve diğer önemli tarama parametreleri ayarlar. Sadece bu süreç kırılgan sondaları ve örnekleri hem koruyor, önemli ölçüde yüksek çözünürlüklü görüntüleri elde etmek için gerekli süreyi azaltır. PF-QNM sıvı AFM görüntüleme için uyumludur; Bu nedenle, biyolojik olarak ilgili malzemeleri görüntülenmesi için geniş bir uygulama alanına sahiptir.
Bu çalışmada sunulan yöntem, fotosentez R. gelen bir bakteriyel kırmızı ışık fotoreseptör, RpBphP3 (P3) görüntüler elde PF-QNM uygulanmasını açıklar onun ışık adapte devlet palustris. Bu yöntem kullanılarak, bireysel protein P3 dimerleri ve dimerlerin agrega bir görüntüleme tampon varlığında bir mika yüzeye gözlenmiştir. Uygun yüzey ayarlamalar ve / veya çözelti konsantrasyonu Bu yöntemle,genel olarak diğer ilgili biyolojik makromoleküller ve yumuşak malzemeler için uygulanabilir.
Introduction
Atomik kuvvet mikroskopisi (AFM) 1986 yılında buluşun (Şekil 1) bu yana yüzeyleri, ince filmlerin ve tek moleküllerin yapısal ve mekanik özelliklerin belirlenmesi için çok önemli bir araç haline gelmiştir. 1-3 sıvı hücreyi kullanarak, bu yöntemin fizyolojik olarak ilgili olan bir ortamda biyolojik makromoleküllerin çalışmaları ve hatta canlı hücrelerde özellikle faydalı olur. AFM geleneksel iletişim modu AFM, çünkü yumuşak bir malzeme veya yüzeyine gevşek bağlı molekülleri görüntülenmesinde kullanılmıştır 4-10 dokunulduğunda mod nedeniyle tipik olarak uygun değildir yanal kuvvetlerin neden zarar dirsek tarafından numune üzerinde uygulanan. 11 dokunulduğunda mod AFM ölçüde ucu aralıklı yüzeyine dokunmayın etmektense sürekli temas ederek bu güçleri azaltır. Bu modda, konsol veya yüzeye normal olarak rezonans frekansına yakın bir döndürülür. Benzer AFM modu başvurma, topografya analxy (uzaklık) bir fonksiyonu olarak z-piezo hareketini taslak haline getirilmesi suretiyle yzed.
Konsol dinamikleri ya da rezonans yanında oldukça kararsız olabilir; Bu nedenle, bir "kararlı durum" durumun dışına otomatikleştirmek için çok zorlu. Özellikle, bu dinamikleri örnek özellikleri ve tarama çevre hem de bağlıdır. Sert bir (er) yüzeyine adsorbe edilmiş yumuşak bir molekül için, molekül için bir iyi ayarlanmış geri besleme döngüsü yüzeyi geri besleme dalgalanmasına yol açabilir. Fazla akışkan Operasyonu konsolun ayarlama zorlaştırmaktadır. Sıcaklık veya sıvı düzeylerindeki değişiklikler set noktası, kazançlar ve diğer görüntüleme parametrelerin sürekli ayarlaması gerekir. Bu ayarlamalar, çok zaman tüketici ve kullanıcılar için zor olma eğilimindedir.
Tepe Kuvvetleri Kantitatif Nanomekanik İşletme Haritalama (PF-QNM), mod AFM dokunarak gibi, aralıklı örnek (Şekil 2) başvurarak yanal etkileşimleri önler. 12-15 </ Sup> Ancak, PF-QNM olmayan rezonans modu ve dokunarak modu AFM çok daha düşük frekanslarda çalışır. Bu çekme modu AFM, sıvı varlığında şiddetlenir özellikle de ayarlama zorlukları ortadan kaldırır. PF-QNM ile, görsel temas her noktada bir kuvvet yanıt eğrisi alınarak toplanır. ScanAsyst yazılım ilavesi ile, tarama parametrelerinin 15 ayar otomatik olabilir ve yüksek çözünürlüklü görüntü bile deneyimsiz kullanıcılar tarafından birkaç dakika içinde elde. Kullanıcı AFM daha aşina olduktan sonra, otomatik parametrelerden herhangi veya tüm görüntü kalitesi elle ince ayar yapmak için deneye izin herhangi bir zamanda devre dışı bırakılmış olabilir. Kuruluşundan bu yana, PF-QNM. Altmoleküler düzeyinde bakteriorodopsin, bir membran proteini ve diğer yerli proteinleri Haritayı uygulanmıştır bakteriyorodopsin için 16-18 protein esneklik ve X-ray kristalografik yapıları arasında doğrudan bir ilişki vardır. 12 PF -QNM yüksek çözünürlüklü canlı hücreler araştırmak için kullanılmıştır. Hücre bütünlüğü ve fonksiyonu için kritik olan eritrosit membran içerisindeki yapı ve mekanik arasındaki 19,20 Dahası, PF-QNM veri açıklığa kavuşturmaktadır önemli bağlantılar. 21
Biz 22 bacteriophytochromes (BphPs) denilen kırmızı ışık fotoreseptör yapısını incelemek için AFM, 23 de dahil olmak üzere, tarama prob mikroskobu (SPM) yöntemlerini kullanmışlardır. 24,25 Onlar kovalent bir sinyal-efektör modülüne böyle bağlantılı bir ışık algılama modülü oluşur histidin kinaz (HK) gibi. 26 ışık algılama modülü genellikle yapısal değişikliklere sinyal-efektör modülü ulaşan ve tüm protein küresel bir dönüşüm yol açan bir dizi, bir fotonun emilimi üzerine yapısal dönüşüme uğrar bir bilin kromofor içeren . Bu dönüşüm dayanarak 24,27-29, iki farklı ışık emici ler vardırBphPs, kırmızı ve uzak-kırmızı ışık emici devletin öngörmesi, Pr ve PFR olarak belirtilir. Pr en BphPs için, termal olarak kararlı, karanlığa adapte edilmiş halidir. Pr / Pfr Fotoçevrim moleküler temeli bütünüyle bağlı olarak, bu proteinlerin sınırlı yapısal bilgisine anlaşılamamıştır 28. D. Bir yapının haricinde radiodurans bu proteinlerin 30 bütün yayınlamış X-ışını kristalografik yapısı, karanlığa adapte edilmiş halde ve efektör yoksundur. Daha sonra, dokunulmamış BphPs etkin Nükleer Manyetik Rezonans (NMR) ile araştırılmıştır için çok büyük olan ve X-ışını kristalografisi için (özellikle ışık uyarlanmış halde) da bütün halinde kristalize etmek oldukça zordur. BphPs yakın kızılötesi floresan protein belirteçleri olarak tasarlanmış edilmiştir (IFP) 'ın., Bu proteinlerin 31 Yapısal karakterizasyon etkili IFP tasarım yardım daha fazla olabilir. 32-36
Bu makalenin odak için bir prosedür sunmaktırPF-QNM yoluyla sıvı hücre AFM kullanılarak BphPs görüntüleme. Bir yöntem olup, fotosentetik bakteri R'nin bacteriophytochrome RpBphP3, (P3) ışık adapte devlet çalışmalarla ortaya konmuştur palustris. Burada sunulan AFM prosedür proteinlerin görüntüleme için uygun ve basit bir yaklaşım hem de diğer biyolojik makro moleküller olduğunu. Bu yöntemle, tek tek moleküllerin yapısal detayları bir üst düzey bilim ders laboratuvar oturumu benzer zaman, kısa bir süre içinde tahsil edilebilir. Kesitlerini ölçmek ve daha boyutlu analiz tamamlayarak, deneysel veri yararlı hesaplama modelleri ile mukayese edilebilir. 37-42
Protocol
Representative Results
Discussion
AFM fizyolojik ilgili koşullarda proteinler ve diğer biyolojik makromoleküllerin görüntüleme tamamen yetenekli bir tarama prob mikroskop yöntemidir. X-ışını kristalografisi ve NMR ile karşılaştırıldığında, AFM biri sınırlama aynı çözünürlüğü, özellikle yanal çözünürlük elde etmek için onun yeteneksizliği. Herhangi bir yüzey üzerinde bir molekül analiz etmek için kullanıldığında, AFM veriler incelendiğinde, molekülün görüntü yüzeyinin etki ve sonda da göz önüne alın…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
NSF-MR program (CHE: 1229103) yeni kontrol elektroniği, yazılım, sıvı hücreleri ve bir çift AFM / STM montajı için gerekli diğer ekipmanların satın finansman için kabul edilmektedir. Biz AFM enstrümantasyon, eğitim ve görüntüleme ile yardım Chicago NSF-MRSEC programının Üniversitesi (DMR-0820054) de ortak tesisler kabul ve enstrüman süre Malzeme Araştırma Olanakları Ağı (DMR-0820054) hazır. Biz özellikle bizim kampüs için gerekli enstrümantasyon getirdi NSF-MR teklifin finansmanı önce öğrencilerimizi ağırlamak için Dr Qiti Guo, Dr Justin Jureller ve Prof Ka Yee Lee teşekkür ederim. Sarf malzemeleri için yaz araştırma öğrenci ve öğretim burslarını yanı sıra destek sağladı Northeastern Illinois Üniversitesi'nde verilir: (P031C110157 ID) Biz Başlık III KÖK hibe fon yny. Son olarak, biz devam enstrümantal destek ve r için izin Bruker-Nano, Inc kabulPeakForce QNM mekanizmasını gösteren bir arsa eproduce ve otomatik yazılım açıklamak için kelime ScanAsyst kullanımı.
Materials
| Name of Material/Equipment | Company | Catalog # | Comments |
| Tris-HCl | Fisher Scientific | O4997-100 | |
| NaCl | Acros Organics | 7647-14-5 | |
| MgCl2 | Acros Organics | 7791-18-6 | |
| Multimode 8 AFM | Bruker-Nano | 492-008-011 | equipped with Nanoscope V controller and J scanner |
| Probe | Bruker-Nano | SNL-10, ScanAsyst-Fluid+ | |
| Tapping Mode Fluid Cell | Bruker-Nano | MTFML | |
| Mica V-4 Grade | SPI supplies | 1150503 | 25 x 25 x .26 mm |
| Sample support disk | nanoSurf | BT02236 | |
| Petri dish | Plasta-Medic, Inc. | 100 mm x 15 mm | |
| micropipettors | Denville Scientific | XL 3000i | |
| RpBphP3 | Prepared according to cited references | ||
| Nanoscope software | Bruker-Nano | ||
| Fiber Optic Light | Digital Instruments Inc. | F0-50 | |
| Pelco AFM Disc Gripper | Ted Pella Inc | 1668 | 12 mm |
| 1 ml syringe | McKesson | 102-ST1C | |
| Eppendorf tubes | Denville Scientific | C2171 | |
| The Pymol Molecular Graphic System v.1.5.0.1 | Schrodinger, LLC |
References
- Binnig, G., Quate, C. F., Gerber, C. Atomic Force Microscope. Phys. Rev. Lett. 56, 930-933 (1986).
- Sonnenfeld, R., Hansma, P. K. Atomic-Resolution Microscopy in Water Science. 232, 211-213 (1986).
- Nikiforov, M. P., Darling, S. B. Concurrent Quantitative Conductivity and Mechanical Properties Measurements of Organic Photovoltaic Materials using AFM. J. Vis. Exp. 71, (2013).
- Bahatyrova, S. The Native Architechure of a Photosynthetic Membrane. Nature. 430, 1058-1061 (2004).
- Sturgis, J. N., Tucker, J. D., Olsen, J. D., Hunter, C. N., Niederman, R. A. Atomic Force Microscopy Studies of Native Photosynthetic Membranes. Biochem. 48, 3679-3698 (2009).
- Pelling, A. E., Li, Y., Shi, W., Gimzewski, J. K. Nanoscale visualization and characterization of Myxococcus xanthus cells with atomic force microscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 102, 6484-6489 (2005).
- Viani, M. B. Probing Protein-Protein Interactions in Real-Time. Nature: Structural Biology. 7, 644-648 (2000).
- Hook, F., Kasemo, B., Grunze, M., Zauscher, S. Quantitative Biological Surface Science, Challenges and Recent Advances. ACS Nano. 2, 2428-2436 (2008).
- Thomas, G., Burnham, N. A., Camesano, T. A., Wen, Q. Measuring the Mechanical Properties of Living Cells Using Atomic Force Microscopy. J. Vis. Exp. (76), (2013).
- Murphy, P. J. M., Shannon, M., Goertz, J. Visualization of Recombinant DNA and Protein Complexes Using Atomic Force Microscopy. J. Vis. Exp. (53), (2011).
- Poggi, M. A. Scanning Probe Microscopy. Anal. Chem. 76, 3429-3444 (2004).
- Rico, F., Su, C., Scheuring, S. Mechanical Mapping of Single Membrane Proteins at Submolecular Resolution. Nano Letters. 11, 3983-3986 (2012).
- Foster, B. The State of Microscopy for 2012. Amer. Lab. 43, 4-6 (2011).
- Guzman, H. V., Perrino, A. P., Garcia, R. Peak Forces in High-Resolution Imaging of Soft Matter in Liquid. ACS Nano. 7, 3198-3204 (2013).
- Kaemmer, S. B. Introduction to Bruker’s ScanAsyst and PeakForce Tapping AFM Technology. , (2011).
- Dufrêne, Y. F., Martinez-Martin, D., Medalsy, I., Alsteens, D., Muller, D. J. Multiparametric imaging of biological systems by force-distance curve-based AFM. Nature Methods. 10, 847-854 (2013).
- Pfreundschuh, M., Martinez-Martin, D., Mulvihill, E., Wegmann, S., Muller, D. J. Multiparametric high-resolution imaging of native proteins by force-distance curve–based AFM. Nature Protocols. 9, 1113-1130 (2014).
- Pfreundschuh, M., Alsteens, D., Hilbert, M., Steinmetz, M. O., Muller, D. J. Localizing Chemical Groups while Imaging Single Native Proteins by High-Resolution Atomic Force Microscopy. Nano Letters. 14, 2957-2964 (2014).
- Berquanda, A. Atomic Force Microscopy Imaging of Living Cells. Microscopy Today. 18, 8-14 (2010).
- Heua, C., Berquand, A., Elie-Cailleb, C., Nicoda, L. Glyphosate-induced Stiffening of HaCaT Keratinocytes, a Peak Force Tapping Study on Living Cells. J. Struc. Biol. 178, 1-7 (2012).
- Picas, L., Rico, F., Deforet, M., Scheuring, S. Structural and Mechanical Heterogeneity of the Erythrocyte Membrane Reveals Hallmarks of Membrane Stability. ACS Nano. 7, 1054-1063 (2013).
- Tobias, F. G. Scanning Probe Microscopy of Bacterial Red-Light. Proc. 1465, doi:10.1557/opl.2012.1006. , (2012).
- Sorenson, B. A. Domain Structure of a Unique Bacterial Red Light Photoreceptor as Revealed by Atomic Force Microscopy. Mater. Res. Soc. Symp. Proc. 1652, (2013).
- Rockwell, N. C., Lagarias, J. C. The structure of phytochrome: a picture is worth a thousand spectra. Plant Cell. 18, 4-14 (2006).
- Rockwell, N. C., Shang, L., Martin, S. S., Lagarias, J. C. Distinct classes of red/far-red photochemistry within the phytochrome superfamily. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106, 6123-6127 (2009).
- Noack, S., Michael, N., Rosen, R., Lamparter, T. Protein conformational changes of Agrobacterium phytochrome Agp1 during chromophore assembly and photoconversion. Biochem. 46, 4164-4176 (2007).
- Noack, S., Lamparter, T. Light modulation of histidine-kinase activity in bacterial phytochromes monitored by size exclusion chromatography, crosslinking, and limited proteolysis. Methods of Enzymology. 423, 203-221 (2007).
- Rockwell, N. C., Su, Y. S., Lagarias, J. C. Phytochrome structure and signaling mechanisms. Annual Review Plant Biology. 57, 837-856 (2006).
- Bhoo, S. H., Davis, S. J., Walker, J., Karniol, B., Vierstra, R. D. Bacteriophytochromes Are Photochromic Histidine Kinases Using a Biliverdin Chromophore. Nature. 414, 776-779 (2001).
- Takala, H. Signal amplification and transduction in phytochrome photosensors. Nature. 509, 245-248 (2014).
- Filonov, G. S. Stable Near-Infared Fluorescent Protein for in vivo Imaging. Nature Biotech. 29, 757-761 (2011).
- Samma, A. A., Johnson, C. K., Song, S., Alvarez, S., Zimmer, M. On the Origin of Fluorescence in Bacteriophytochrome Infrared Fluorescent Proteins. J. Phys. Chem. B. 114, 15362-15369 (2011).
- Lehtivuori, H. Fluorescence Properties of the Chromophore-Binding Domain of Bacteriophytochrome from Deinococcus radiodurans. J. Phys. Chem. B. 117, 11049-11057 (2013).
- Toh, K. C. Primary Reactions of Bacteriophytochrome Observed with Ultrafast Mid-Infrared Spectroscopy. J. Phys. Chem. A. 115, 3778-3786 (2011).
- Auldridge, M. E., Satyshur, K. A., Anstrom, D. M., Forest, K. T. Structure-guided engineering enhances a phytochrome-based infrared fluorescent protein. J. Biol. Chem. 287, 7000-7009 (2012).
- Toh, K. C., Stojkovic, E. A., van Stokkum, I. H., Moffat, K., Kennis, J. T. Proton-transfer and hydrogen-bond interactions determine fluorescence quantum yield and photochemical efficiency of bacteriophytochrome. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 107, 9170-9175 (2010).
- . The Pymol Molecular Graphic System v.1.5.0.1. , .
- Yang, X., Stojkovic, E. A., Kuk, J., Crystal Moffat, K. structure of the chromophore binding domain of an unusual bacteriophytochrome, RpBphP3, reveals residues that modulate photoconversion. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104, 12571-12576 (2007).
- Yang, X., Kuk, J., Moffat, K. Crystal structure of Pseudomonas aeruginosa bacteriophytochrome: photoconversion and signal transduction. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105, 14715-14720 (2008).
- Woitowich, N. K., Garrido, C., Ozarowski, W., Stojkovic, E. A. Preliminary X-ray Crystallographic and Structural Analyses of a Bacteriophytochrome from Stigmatella aurantiaca. The FASEB Journal. 25, 928 (2011).
- Wagner, J. R., Zhang, J., Brunzelle, J. S., Vierstra, R. D., Forest, K. T. High resolution structure of Deinococcus bacteriophytochrome yields new insights into phytochrome architecture and evolution. J. Biol. Chem. 282, 12298-12309 (2007).
- Wagner, J. R. Mutational analysis of Deinococcus radiodurans bacteriophytochrome reveals key amino acids necessary for the photochromicity and proton exchange cycle of phytochromes. J. Biol. Chem. 283, 12212-12226 (2008).
