الكمي في وقت واحد T-خلية الدوائر مستقبلات الختان (TRECs) والدوائر K-حذف إعادة التركيب الختان (KRECs) من قبل في الوقت الحقيقي PCR
Summary
Here, we describe a method for simultaneous quantification of T-cell receptor excision circles (TRECs) and K-deleting recombination excision circles (KRECs). The TREC/KREC assay can be used as marker of thymic and bone marrow output.
Abstract
T-cell receptor excision circles (TRECs) and K-deleting recombination excision circles (KRECs) are circularized DNA elements formed during recombination process that creates T- and B-cell receptors. Because TRECs and KRECs are unable to replicate, they are diluted after each cell division, and therefore persist in the cell. Their quantity in peripheral blood can be considered as an estimation of thymic and bone marrow output. By combining well established and commonly used TREC assay with a modified version of KREC assay, we have developed a duplex quantitative real-time PCR that allows quantification of both newly-produced T and B lymphocytes in a single assay. The number of TRECs and KRECs are obtained using a standard curve prepared by serially diluting TREC and KREC signal joints cloned in a bacterial plasmid, together with a fragment of T-cell receptor alpha constant gene that serves as reference gene. Results are reported as number of TRECs and KRECs/106 cells or per ml of blood. The quantification of these DNA fragments have been proven useful for monitoring immune reconstitution following bone marrow transplantation in both children and adults, for improved characterization of immune deficiencies, or for better understanding of certain immunomodulating drug activity.
Introduction
الدوائر مستقبلات الخلايا T-الختان (TRECs) والدوائر إعادة التركيب الختان حذف K (KRECs) هي عناصر DNA الدائرية الصغيرة التي رفعه في نسبة البائية والخلايا، على التوالي، وذلك خلال عملية إعادة التركيب الحمض النووي الجيني، مما أدى إلى تشكيل ذخيرة متنوعة للغاية من T- ومستقبلات B-الخلية. ليس لديهم وظيفة، ولكن لأنها مستقر ولا يمكن تكرارها، والمخفف أنهم بعد كل انقسام الخلايا، وبالتالي استمرار فقط في واحدة من خلايا ابنة اثنين. ولذلك، مستوياتها في الدم المحيطي يمكن افتراض بمثابة تقدير للالتوتة والعظام الناتج نخاع.
في حين أن الفحص TREC وقد تستخدم إلى حد كبير على مدى السنوات ال 15 الماضية لتقييم مدى انتاج الغدة الصعترية (1)، فحص KREC، والذي تم تطويره في البداية لقياس انتشار B-الخلية ومساهمتها في التوازن B-خلية في الصحة والمرض، 2 وقد اقترح مؤخرا فقط كعلامة من العظام مالسهم الانتاج. 3،4 هنا، نحن تصف طريقة وضعنا لتقدير وقت واحد من كل من TRECs وKRECs. 4
مع هذا الأسلوب المشترك، يتم التخلص من التقلبات المرتبطة الكمي الحمض النووي عن طريق الوقت الحقيقي PCR باستخدام منحنى قياسي فريد من نوعه تم الحصول عليها عن طريق تمييع البلازميد الثلاثي إدراج تحتوي على شظايا من TRECs، KRECs وT-خلية مستقبلات ألفا ثابتة (TCRAC) الجينات في نسبة 1: 1: 1. وهذا يسمح تقييم أكثر دقة للTREC وKREC عدد النسخ. وعلاوة على ذلك، فإن الكمي في وقت واحد من الهدفين في نفس رد الفعل يسمح خفض التكاليف كاشف.
الفحص TREC / KREC المقترحة يمكن أن تكون مفيدة لقياس مدى البائية والخلايا الجدد الإنتاج في الأطفال أو البالغين الذين يعانون من نقص المناعة الشديد المجمعة (SCID)، 4 نقص المناعة المتغير المشترك، 5 أمراض المناعة الذاتية، 6-8 وفيروس نقص المناعة البشرية 9 وعلاوة على ذلك، فإنه يمكن استخدامها لمراقبة الانتعاش المناعة بعد زرع الخلايا الجذعية المكونة للدم، و 10 استبدال إنزيم و 11 و المضادة للفيروسات 9 أو المناعة العلاجات. 6-8 وأخيرا، ليتم التعرف على مرضى SCID باستخدام TREC فحص على الرغم من العيوب الوراثية الكامنة، وفقد غاماغلوبولين الدم المرضى يمكن تحديدها باستخدام KREC الكمي وفحص TREC / KREC يمكن استخدامها أيضا للكشف عن نقص المناعة في برامج فحص حديثي الولادة. 12 وفي هذه الحالة، يجب إجراء اختبار على الحمض النووي المستخرج من بقع صغيرة من الدم نشف وتجفف على ورق الترشيح، يجب أن تكون حساسة للغاية ومحددة ل الأمراض المستهدفة، وكذلك استنساخه للغاية وفعالة من حيث التكلفة.
إدخال KREC الكمي في اختبار يجب تحسين أداء فحص حديثي الولادة لنقص المناعة، والتي عادة أجريت في بعض أجزاء من الولايات المتحدة الأمريكية (WI، MA، CA) منذ عام 2008 عندما أصبحت ولاية ويسكونسن أول من introducالبريد تحليل TRECs في برنامجها فحص ما بعد الولادة. 13
Protocol
Representative Results
Discussion
TREC and KREC quantification can be considered a good estimate of recent thymic and bone marrow output provided that some caveats are taken into account. Even though an absolute quantification method employing standard curve requires more reagents and more space on the real-time PCR reaction plate, it ensures highly accurate quantitative results because unknown sample quantities are interpolated from standard curves built upon known amounts of starting material. Moreover this method is better fitted to detect low amount …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors have no acknowledgements.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Histopaque-1077 | Sigma Aldrich SRL | 10771-500 ML | density gradient separation method |
| QIAamp DNA Blood Mini Kit (250) | QIAGEN | 51106 | DNA extraction |
| Unmodified DNA Oligonucleotides HPSF 0.01 mmol | Eurofins MWG Operon/Carlo Erba Reagents S.r.l | Resuspend the lyophilized product to 100 picmol/µl | |
| AmpliTaq DNA Polymerase: including 10x Buffer II and 25mM MgCl2 | Applied Biosystems/Life-Technologies | N8080156 | |
| GeneAmp dNTP Blend (100 mM) | Applied Biosystems/Life-Technologies | N8080261 | |
| TOPO TA Cloning Kit for Subcloning | Invitrogen/Life-Technologies | K4500-01 | |
| XL1-Blue Subcloning Grade Competent Cells | Stratagene | 200130 | |
| PureYield Plasmid Miniprep System | Promega | A1223 | |
| SpeI 500U | New England Biolabs | R0133S | |
| HindIII-HF 10,000 U | New England Biolabs | R3104S | |
| PureYield Plasmid Midiprep System | Promega | A2492 | |
| XhoI 5,000 U | New England Biolabs | R0146S | |
| TRIS Utrapure | Sigma Aldrich SRL | T1503 | |
| EDTA | Sigma Aldrich SRL | E5134 | |
| TE buffer (1 mM TRIS and 0.1 mM EDTA) | |||
| TaqMan Universal PCR Master Mix | Applied Biosystems/Life-Technologies | 4364338 | |
| Dual labeled probes HPLC 0.01 mmol | Eurofins MWG Operon/Carlo Erba Reagents S.r.l | Resuspend the lyophilized product to 100 picmol/µl | |
| NanoDrop 2000c spectrophotometer | ThermoFisher | ||
| Applied Biosystems 2720 Thermal Cycler | Applied Biosystems/Life-Technologies | 4359659 | |
| Fast 7500 Real-Time PCR system | Applied Biosystems/Life-Technologies | ||
| SDS Sequence Detection Software 1.4 | Applied Biosystems/Life-Technologies |
References
- Douek, D. C., et al. Changes in thymic function with age and during the treatment of HIV infection. Nature. 396 (6712), 690-695 (1998).
- Zelm, M. C., Szczepanski, T., van der Burg, M., van Dongen, J. J. M. Replication history of B lymphocytes reveals homeostatic proliferation and extensive antigen-induced B cell expansion. J. Exp. Med. 204 (3), 645-655 (2007).
- Fronkova, E., et al. B-cell reconstitution after allogeneic SCT impairs minimal residual disease monitoring in children with ALL. Bone Marrow Transplant. 42 (3), 187-196 (2008).
- Sottini, A., et al. Simultaneous quantification of recent thymic T-cell and bone marrow B-cell emigrants in patients with primary immunodeficiency undergone to stem cell transplantation. Clin. Immunol. 136 (2), 217-227 (2010).
- Serana, F., et al. Thymic and bone marrow output in patients with common variable immunodeficiency. J. Clin. Immunol. 31 (4), 540-549 (2011).
- Zanotti, C., et al. Opposite effects of interferon-β on new B and T cell release from production sites in sclerosis. J. Neuroimmunol. 240-241, 147-150 (2011).
- Zanotti, C., et al. Peripheral accumulation of newly produced T and B lymphocytes in natalizumab-treated multiple sclerosis patients. Clin. Immunol. 145 (1), 19-26 (2012).
- Sottini, A., et al. Pre-existing T- and B-cell defects in one progressive multifocal leukoencephalopathy patient. PLoS One. 7, e34493 (2012).
- Quiros-Roldan, E., et al. Effects of combined antiretroviral therapy on B- and T-cell release from production sites in long-term treated HIV-1+ patients. J. Transl. Med. 10, 94 (2012).
- Mensen, A., et al. Utilization of TREC and KREC quantification for the monitoring of early T- and B-cell neogenesis in adult patients after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation. J. Transl. Med. 11, 188 (2013).
- Serana, F., et al. The different extent of B and T cell immune reconstitution after hematopoietic stem cell transplantation and enzyme replacement therapies in SCID patients with adenosine deaminase deficiency. J. Immunol. 185 (12), 7713-7722 (2010).
- Borte, S., et al. Neonatal screening for severe primary immunodeficiency diseases using high-throughput triplex real-time PCR. Blood. 119 (11), 2552-2555 (2012).
- Baker, M. W., et al. Implementing routine testing for severe combined immunodeficiency within Wisconsin’s newborn screening program. Public Health Rep. 125 (2), 88-95 (2010).
- Lorenzi, A. R., et al. Determination of thymic function directly from peripheral blood: a validated modification to an established method. J. Immunol. Meth. 339 (2), 185-194 (2008).
- De Boer, R. J., Perelson, A. S. Quantifying T lymphocyte turnover. J. Theor. Biol. 327, 45-87 (2013).
